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脂蛋白脂肪酶elisa方法說明書
閱讀：600 發(fā)布時間：2021-11-11| 提 供 商 | 上海撫生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 21KB |
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| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數 | 600次 |
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脂蛋白脂肪酶elisa方法說明書
特點：
1、高效,、靈敏、特異的抗體;
2,、穩(wěn)定的重復性和可靠性;
3,、吸附性能好，空白值低,，孔底透明度高的固相載體;
4,、適用血清、血漿,、組織勻漿液,、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型,。
試驗原理：
ES試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知ES濃度的標準品,、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將ES和生物素標記的抗體同時溫育,。洗滌后,，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,，去除未結合的酶結合物,，然后加入底物A、B,，和酶結合物同時作用,。產生顏色。顏色的深淺和樣品中ES的濃度呈比例關系,。
樣本處理及要求：
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如出現沉淀，應再次離心,。
2.血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實行,。
4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清,。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應再次離心,。
5.組織標本：切割標本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）,。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。
標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品,。稀釋度的線性,。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應,。
3. 重復性：板內,、板間變異系數均小于10%。
操作步驟：
1． 使用前,，將所有試劑充分混勻,。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡,，產生加樣上的誤差,。
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔,。每個樣品根據自己的數量來定,，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內,。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔,、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。
4． 甩去孔內液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復此操作3次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干,。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數增加一次,。
7． 每孔加入底物A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘。避免光照,。
8． 取出酶標板,，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果,。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值,。
4、敏感度： 0.1 pg/ml
結果判斷與分析：
1,、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2,、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的ES標準品濃度為橫坐標（X）,，做得相應的曲線,，樣品的ES含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3,、檢測值范圍：0-240pg/ml
操作注意事項：
1． 試劑應按標簽說明書儲存,，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,，不可保存,。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存,，以免變質,。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用,。保質前使用,。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A,、B液時,，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。
6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7． 底物A應揮發(fā),，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值,。
8． 加入試劑的順序應一致,，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標明的時間,、加液的量及順序進行溫育操作,。