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貓血支原體探針法熒光定量PCR試劑盒說明書
閱讀：699 發(fā)布時間：2020-10-23| 提 供 商 | 上海撫生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 42.5KB |
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| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 699次 |
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貓血支原體探針法熒光定量PCR試劑盒說明書
1,、 試劑盒簡介貨為了適應(yīng)貓血支原體探針法熒光定量PCR試劑盒快速檢測和疫病研究的需要,，本公司參照 OIE 標(biāo)準中規(guī)定的引物序列,，經(jīng)多次實驗及系統(tǒng)優(yōu)化,，開發(fā)了本試劑盒,。應(yīng)用本試劑盒進行檢測具有快速,、靈敏、特異,、準確,、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點及優(yōu)點,。2,、試劑盒組成:
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1,、2 和試劑盒須在-20℃保存,。
2、樣本采集,，存放及運輸
2.1 樣本采集
所用取樣器材必須經(jīng)過高壓滅菌并烘干,。取對蝦的腮絲、肝胰腺,、腹肢等組織各30mg標(biāo)記后置于離心管中,，按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板,。
2.2 存放
研磨后的樣本應(yīng)盡快提取 DNA；待測樣本應(yīng)避免凍融,。
2.3 運輸
采用或泡沫箱加冰密封進行運輸,。
3.1 PCR 檢測
3.1.1 擴增試劑準備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶,，2000×g 離心 5 秒鐘,。每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2。
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
3.1.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液,，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL,，蓋緊管蓋，500
r/min 離心 30 s,。
3.1.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）： 階段,，95 ℃/3 min；
第二階段,，94 ℃/30 sec,，60 ℃/30sec；72℃/1 min,；35個循環(huán),；
第三階段,，72 ℃/7 min,； 第四階段，4 ℃ 保存
3.1.4 瓊脂糖電泳
用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板,。將平板放入水平電泳槽,，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，向 PCR 擴增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液）,，按比例混勻后加入樣品孔,。在電泳時設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5h,，當(dāng)溴酚藍到達一定位置時停止,。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記錄,。
4,、檢測步驟
4.1.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)：
取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和,，對每個管進行編號標(biāo)記,。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 μl DNA 提取液 1,，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100μl,，一份樣本換用一個吸頭,；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min,。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀,，再加入 10μl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下,，2 000 r/min 離心 10 s,。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90μl DEPC 水,，12 000 r/min 離心 10 min,，吸取上清， 即為提取的 DNA,，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）,。
5、結(jié)果判定
5.1 PCR 后,，陽性對照會出現(xiàn)一條 196bp 的 DN段,。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 待測樣品 PCR 擴增后能在相應(yīng) 196 bp DNA 位置上有帶,，可判為 BP 核酸陽性,。
6、相關(guān)技術(shù)信息
F: 5’-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’
R: 5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’