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鮑球狀病毒探針法熒光定量PC試劑盒說明書
閱讀：6068 發(fā)布時(shí)間：2020-3-27| 提 供 商 | 上海撫生實(shí)業(yè)有限公司 | 資料大小 | 24.5KB |
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鮑球狀病毒探針法熒光定量PC試劑盒說明書
1,、 試劑盒簡介貨
為了適應(yīng)鮑球狀病毒探針法快速檢測和疫病研究的需要,，本公司參照 OIE 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的引物序列,，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化,，開發(fā)了本試劑盒,。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速,、靈敏、特異,、準(zhǔn)確,、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn),。
2,、試劑盒組成:
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
組成成分
體積
樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
BP PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul) 陰性對照
BP 陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1,、2 和試劑盒須在-20℃保存,。
3、樣本采集,，存放及運(yùn)輸
3.1 樣本采集
所用取樣器材必須經(jīng)過高壓滅菌并烘干,。取對蝦的腮絲、肝胰腺,、腹肢等組織各30mg標(biāo)記后置于離心管中,，按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板。
3.2 存放
研磨后的樣本應(yīng)盡快提取 DNA,；待測樣本應(yīng)避免凍融,。
3.3 運(yùn)輸
采用或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
4,、檢測步驟
4.1.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)：
取 n 個(gè) 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管,，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個(gè)管進(jìn)行編號標(biāo)記,。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板,，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl,，一份樣本換用一個(gè)吸頭,；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min,。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀,，再加入 10µl DNA 提取液 2,，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下，2 000 r/min 離心 10 s,。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min,；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min,，吸取上清,， 即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）,。
4.1 PCR 檢測
4.1.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的 PCR 反應(yīng)液,、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘,。每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2,。
表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑
PCR 反應(yīng)液
Taq 酶
合計(jì)
用量
14.5 μL
0.5μL
15μL
4.1.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
向每個(gè) PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL,，蓋緊管蓋,，500
r/min 離心 30 s。
4.1.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）： 階段,，95 ℃/3 min,；
第二階段，94 ℃/30 sec,，60 ℃/30sec,；72℃/1 min；35個(gè)循環(huán),；
第三階段,，72 ℃/7 min； 第四階段,，4 ℃ 保存
4.3 瓊脂糖電泳
用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板,。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠面,，向 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液）,，按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對照,。5 V/cm 電泳約 0.5h,，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定位置時(shí)停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶,，拍攝并記錄,。
5、結(jié)果判定
5.1 PCR 后,，陽性對照會(huì)出現(xiàn)一條 196bp 的 DNA 片段,。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶,。
5.2 待測樣品 PCR 擴(kuò)增后能在相應(yīng) 196 bp DNA 位置上有帶，可判為 BP 核酸陽性,。
6,、相關(guān)技術(shù)信息
F: 5’-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’
R: 5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’