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閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值,，熒光信號(hào)大于熒光閾值時(shí)PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值設(shè)為基線（baseline）,，是由于測(cè)量的偶然誤差引起的,。閾值（threshold）一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中也可以手動(dòng)調(diào)節(jié),。高于閾值的熒光信號(hào)被認(rèn)為是真實(shí)的信號(hào),，用于定義Ct值。Ct會(huì)受到閾值的影響,，每次試驗(yàn)由于樣品和儀器的不同會(huì)導(dǎo)致基線不同,，進(jìn)而影響閾值和Ct值,。

模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高,，Ct值越?。黄鹗寄０辶繚舛仍降?，Ct值越大,。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期）,，此時(shí)微小誤差尚未放大,，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板,，得到的Ct值是相對(duì)穩(wěn)定的,。Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品,、不同儀器的影響,，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會(huì)存在差異,。

1,、與Ct值有關(guān)的參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),，縱坐標(biāo)代Ct值。

相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) ：反映了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性,，通常要求>0.99,。

擴(kuò)增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%,，是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素,；而高于100%可能一些污染、非特異性擴(kuò)增或者是引物二聚體造成,。

斜率Slope ：當(dāng)擴(kuò)增效率為100%時(shí)斜率為-3.32,，當(dāng)90%-110%時(shí)的斜率為-3.58 ~ -3.10。

2,、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系

理想情況下,，qPCR的模板經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)數(shù)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴(kuò)增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴(kuò)增效率E）^循環(huán)數(shù)n,。但是由于E通常無(wú)法達(dá)到100%,，并且在擴(kuò)增的后期，擴(kuò)增效率會(huì)逐漸降低,，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n,，即Ct值差1,，初始濃度差2倍。

由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定。這是目前的qPCR定量的方法,，即用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與未知濃度樣品同時(shí)擴(kuò)增,，將未知濃度樣品的Ct值代入該標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時(shí),，一般取Ct:15-35,。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。標(biāo)準(zhǔn)曲線需滿足：E：90%~110%,，R^2≥0.99,，斜率-3.58 ~ -3.10。同時(shí)定量標(biāo)準(zhǔn)品的量值需要準(zhǔn)確可靠,。用qPCR進(jìn)行定量,，理論上可行，實(shí)際上很難獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果,。