化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
PCR反應(yīng)DNA 復(fù)制過程解讀
閱讀：97 發(fā)布時(shí)間：2025-1-21 PCR全稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）,，是一種非常強(qiáng)大的技術(shù),，可以通過一種非常簡(jiǎn)單但是高效的方法來復(fù)制DNA,，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。
復(fù)制DNA必要性：
DNA復(fù)制是很多研究的基礎(chǔ),，例如，當(dāng)我們對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序時(shí),，必須先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA,，并進(jìn)行大量復(fù)制。在對(duì)于某個(gè)人進(jìn)行基因組測(cè)序時(shí)，我們不能對(duì)于某個(gè)細(xì)胞或者單個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序,。測(cè)序的基礎(chǔ)要求擁有大量的相同的DNA分子拷貝,，因此，DNA復(fù)制是做生物研究中的基礎(chǔ)工具,。那么怎么獲取這么多拷貝呢,？PCR正是一個(gè)復(fù)印機(jī)一般的存在，利用DNA的幾個(gè)特性,，成為批量復(fù)制DNA的方法。
PCR原理及步驟：
說到原理,，我們就要回顧一下DNA結(jié)構(gòu)：
DNA分子兩條單鏈以雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)成,，DNA兩條鏈擁有自行粘附的特性，A與T配對(duì),，C與G配對(duì),，DNA粘附特性是PCR的核心原理。同時(shí)DNA復(fù)制時(shí)也是具有方向性的,，DNA序列的開始端稱為5‘端,，末端稱為3’端。
在復(fù)制時(shí),，需要加入一種叫做引物（primers）的東西,。可以將引物理解為一個(gè)短序列,，下圖中紅色的部分就是引物,。引物通常15到20個(gè)堿基，可以短一些,，也可以長(zhǎng)一些,。但是必須和我們想合成的DNA片段成互補(bǔ)關(guān)系。將引物與DNA鏈混合時(shí),，會(huì)自動(dòng)粘在上面,，因?yàn)樗麄兪腔パa(bǔ)的。引物獲得可以從公司訂購,，后續(xù)有機(jī)會(huì)我們也會(huì)分享引物設(shè)計(jì)方法,。
PCR過程分三步：
變性--退火--延伸，PCR中會(huì)對(duì)這三步循環(huán)播放,。
A. 變性
在開始準(zhǔn)備變性的過程中,，要慢慢加熱混合物，加熱混合物時(shí),，兩條鏈間氫鍵會(huì)融化,，DNA兩股鏈會(huì)分開，就像上圖粉色的部分。如果混合物熱的情況下,，引物不會(huì)和DNA黏在一起,，兩條DNA鏈也不會(huì)黏在一起。
B. 退火
接下來混合物慢慢的冷卻,，這時(shí)引物會(huì)黏在DNA上,，因?yàn)橐镙^小，更容易漂浮起來,，和DNA結(jié)合,。溫度控制在54攝氏度左右可以保證引物序列和DNA互補(bǔ)配對(duì)，而DNA雙鏈不會(huì)黏在一起,。
C. 延伸
這一步我們需要一個(gè)幫助DNA復(fù)制的工具,，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的聚合酶（polymerase）。下圖中綠色的圖形就代表著DNA聚合酶,，所到之處萬物生,，這也是我們身體各個(gè)細(xì)胞中用來復(fù)制DNA的工具。聚合酶的作用方式也非常生猛,，直接找到部分單鏈,，部分雙鏈的地方，咬住那里的序列開始進(jìn)行復(fù)制,。也就是說聚合酶會(huì)先找到引物,，開始沿著引物進(jìn)行缺失的序列填充。如下圖中看到的,，在一輪填充序列后,，引物所在的鏈條（橙色鏈）會(huì)被補(bǔ)齊。這一步中會(huì)加入As, Cs, Gs和Ts這些DNA原材料,，這樣可以把他們整合到新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,。這一步的溫度稍微高一些，大概是72攝氏度,。最初我們加入的是雙鏈DNA,，在一個(gè)周期后，我們會(huì)獲得四條鏈,，兩個(gè)周期后獲得8條鏈,，30個(gè)周期后，會(huì)獲得10億條DNA鏈,。
DNA 復(fù)制所需的基本要素：
DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在 DNA 聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝,。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),，DNA 在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物,，DNA 聚合酶,，dNTP 就可以完成特定基因的體外復(fù)制，這是 PCR 的理論基礎(chǔ),。PCR 反應(yīng)是在體外模擬 DNA 的復(fù)制過程,，因此反應(yīng)體系中必須具有 DNA 復(fù)制所需的基本要素：
1、模板（template）,，含有需要擴(kuò)增的 DNA 片段,。
2、引物（primer）,，一對(duì)引物決定了需要擴(kuò)增的起始和終止位置。
3,、聚合酶（polymerase ）,，DNA 聚合酶復(fù)制需要擴(kuò)增的區(qū)域。
4,、脫氧核苷三磷酸（dNTP）,，用于構(gòu)造新的互補(bǔ)鏈。
5,、緩沖液（buffer）,，提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。