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微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基應(yīng)用技巧匯集
閱讀：105 發(fā)布時(shí)間：2025-1-14 培養(yǎng)基是液體,、半固體或固體形式的，含天然或合成成分,，用于保證微生物繁殖或保持其活力的物質(zhì),。培養(yǎng)基的制備和使用是微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)基自身質(zhì)量的優(yōu)劣,、保存是否得當(dāng),、配制使用是否正確等都直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
一,、培養(yǎng)基的購(gòu)置與驗(yàn)收
1.購(gòu)置
從培養(yǎng)基自身的質(zhì)量來(lái)看,，不同生產(chǎn)廠(chǎng)家的產(chǎn)品，甚至同一廠(chǎng)家不同批號(hào)的產(chǎn)品都會(huì)存在差異,。依據(jù)ISO/IEC17025《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》,，對(duì)培養(yǎng)基的供應(yīng)企業(yè)進(jìn)行評(píng)價(jià)后選擇合格的供應(yīng)商,，這是培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)過(guò)程中重要的步驟。應(yīng)選擇產(chǎn)品市場(chǎng)信譽(yù)度高,、有質(zhì)量保證能力和服務(wù)保證能力的企業(yè);企業(yè)是否通過(guò)了質(zhì)量管理體系的認(rèn)證是較為客觀(guān)的評(píng)價(jià)指標(biāo),。要求生產(chǎn)企業(yè)提供：培養(yǎng)基成分名稱(chēng)及產(chǎn)品編號(hào)、批號(hào),、使用前的pH,、儲(chǔ)藏信息和有效期、性能評(píng)價(jià)和所用測(cè)試菌株,、技術(shù)數(shù)據(jù)清單,、質(zhì)控證書(shū)以及必要的安全/危害數(shù)據(jù)等材料。
2.驗(yàn)收
購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基到貨后,，應(yīng)有專(zhuān)人做好接受和驗(yàn)收工作,，應(yīng)仔細(xì)核對(duì)生產(chǎn)企業(yè)提供的資料、培養(yǎng)基名稱(chēng),、規(guī)格數(shù)量,、外觀(guān)特征、批號(hào),、保質(zhì)期是否符合要求,。每批培養(yǎng)基到貨物后都應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，滿(mǎn)足檢測(cè)方法規(guī)定的要求后方可投入使用,。
二,、培養(yǎng)基的儲(chǔ)存
干粉培養(yǎng)基應(yīng)保存在陰涼干燥處，要避免陽(yáng)光直射;未開(kāi)瓶的培養(yǎng)基在室溫下的最長(zhǎng)保存2年,，開(kāi)瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕,，應(yīng)注意防潮并在6個(gè)月內(nèi)用完。應(yīng)定期對(duì)儲(chǔ)存中的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)檢查,，如容器密閉性復(fù)查、第1次開(kāi)封日期,、內(nèi)容物的感官檢查,，如果培養(yǎng)基發(fā)生結(jié)塊、顏色異常和其他變質(zhì)跡象就不能再使用,。
三,、培養(yǎng)基的制備
1.培養(yǎng)基用水
培養(yǎng)基制備用水應(yīng)使用電阻率不小于30萬(wàn)Ωcm的蒸餾水或與其同質(zhì)的水，最好不使用離子交換器生產(chǎn)的去離子水,。
2.稱(chēng)量
稱(chēng)量時(shí)要用專(zhuān)用的角匙,，避免交叉污染而影響檢驗(yàn)結(jié)果;干粉培養(yǎng)基易吸潮，如有條件,，盡量在濕度較低的房間稱(chēng)取培養(yǎng)基,。
3.復(fù)水
復(fù)水時(shí)不得用銅鍋或鐵鍋,，以防有離子混入培養(yǎng)基中，影響微生物的生長(zhǎng);容器的大小需大于復(fù)水后培養(yǎng)基總體積的2倍以上,，避免在加熱溶解過(guò)程中,，培養(yǎng)基溢出;含有瓊脂粉的培養(yǎng)基，在加熱溶解之前可以浸泡數(shù)分鐘;加熱培養(yǎng)基時(shí)一定要進(jìn)行攪拌,，特別是瓊脂類(lèi)培養(yǎng)基,。為避免燒焦和沸騰溢出，對(duì)于少量的培養(yǎng)基最好使用沸水浴進(jìn)行加熱,。燒糊的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被破壞,，并可產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如發(fā)現(xiàn)焦化,，或未溶解均勻前培養(yǎng)基有溢出,，該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備,。對(duì)于瓊脂類(lèi)培養(yǎng)基進(jìn)行再融化時(shí)應(yīng)使用沸水浴或流動(dòng)蒸汽進(jìn)行加熱,，最多只能加熱兩次，第二次再融化后仍未用完的培養(yǎng)基應(yīng)棄去,。
4.滅菌
一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌,，即高壓蒸汽滅菌，通常是121℃ 15min,，含糖或特殊培養(yǎng)基,，按照或生產(chǎn)商提供的說(shuō)明滅菌。已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌,，避免微生物生長(zhǎng)繁殖而消耗養(yǎng)分,，改變培養(yǎng)基的酸堿度。高溫可破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分,，還會(huì)使瓊脂的凝膠強(qiáng)度下降,，因此必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時(shí)間，并且不可重復(fù)滅菌,。高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表等要定期進(jìn)行檢定,，并定期采用生物指示菌法或化學(xué)變色紙片對(duì)滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。
5.pH測(cè)定
微生物必須在適宜的pH范圍內(nèi)才能正常生長(zhǎng)繁殖或體現(xiàn)其生物特性,。培養(yǎng)基配方要求的pH為滅菌或消毒后的pH值,，即培養(yǎng)基使用前的pH，并應(yīng)在25℃溫度下采用精密酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)量,，固體瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)以特殊的膠體表面測(cè)量電極進(jìn)行測(cè)量,。使用過(guò)程中，如果需要調(diào)整培養(yǎng)基的pH,，應(yīng)用1mol/LNa0H或 lmol/LHCL調(diào)整,，注意不可反復(fù)調(diào)pH,，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的滲透壓。
6.配制好的培養(yǎng)基保存
滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)該迅速冷卻至所需溫度,，避免長(zhǎng)時(shí)間保存在滅菌鍋內(nèi),，造成過(guò)度滅菌，影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分或選擇性效果,。所配制的培養(yǎng)基的量,，應(yīng)該是在最長(zhǎng)保存期限內(nèi)正好使用完。含染料的培養(yǎng)基應(yīng)閉光保存;倒好的瓊脂平板如果配制的當(dāng)天未使用完,，應(yīng)于冷藏保存,，如果保存時(shí)間超過(guò)2天，應(yīng)將其放入密封的塑料袋中保存;配好的肉湯類(lèi)培養(yǎng)基如果保存時(shí)間超過(guò)2個(gè)星期,，應(yīng)將其放在帶有螺旋蓋的試管或其它密閉的試管或容器中防止蒸發(fā),。
四、培養(yǎng)基的性能測(cè)試
1.外觀(guān)控制
制備好的培養(yǎng)基應(yīng)有相應(yīng)的顏色,，一般的培養(yǎng)基應(yīng)澄清,、無(wú)渾濁、無(wú)沉淀,。使用前應(yīng)檢查培養(yǎng)基的顏色是否發(fā)生變化,，是否蒸發(fā)/脫水。
2.污染控制
從每批制備好的培養(yǎng)基中選取部分進(jìn)行污染測(cè)試(無(wú)菌試驗(yàn)),，確定無(wú)微生物生長(zhǎng)方可使用,。
3.性能測(cè)試
(1)測(cè)試菌株選擇 測(cè)試菌株是具有其代表種的穩(wěn)定特性并能有效證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株，應(yīng)來(lái)自國(guó)際/菌種保藏中心ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株,，菌株的選擇參考衛(wèi)生WS/T232-2002《商業(yè)性微生物培養(yǎng)基質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)程》,。
(2) 定量測(cè)試方法(改良Miles-Misra法) 測(cè)試菌株過(guò)夜培養(yǎng)物10倍遞增稀釋;測(cè)試平板和參照平板劃分為4個(gè)區(qū)域并標(biāo)記;從最高稀釋度開(kāi)始，分別滴一滴稀釋液于試驗(yàn)平板和對(duì)照平板標(biāo)記好的區(qū)域;將稀釋液涂滿(mǎn)整個(gè)1/4區(qū)域,，37°C培養(yǎng)18小時(shí);對(duì)易計(jì)數(shù)的區(qū)域計(jì)數(shù),，按公式計(jì)算生長(zhǎng)率(生長(zhǎng)率=待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)/參考培養(yǎng)基平板上獲得的菌落總數(shù))。非選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率應(yīng)不低于0.7,，該類(lèi)培養(yǎng)基應(yīng)易于目標(biāo)菌生長(zhǎng);選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率應(yīng)不低于0.1,。
(3)半定量測(cè)試方法(改進(jìn)的劃線(xiàn)法接種法) 平板分ABCD四區(qū)，共劃16條線(xiàn),，平行線(xiàn)大概相隔0.5cm，每條有菌落生長(zhǎng)的劃線(xiàn)記作1分,，每個(gè)僅一半的線(xiàn)有菌落生長(zhǎng)記作0.5分,，沒(méi)有菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)量少于劃線(xiàn)的一半記作0分，分?jǐn)?shù)加起來(lái)得到生長(zhǎng)指數(shù)G,。目標(biāo)菌在培養(yǎng)基上應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長(zhǎng),，而非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)應(yīng)部分或全被抑制,，目標(biāo)菌的生長(zhǎng)指數(shù)G大于6時(shí)，培養(yǎng)基可接受,。
(4)定性測(cè)試方法(平板接種觀(guān)察法) 用接種環(huán)取測(cè)試菌培養(yǎng)物,，在測(cè)試培養(yǎng)基表面劃平行直線(xiàn)。按標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)接種后的平板進(jìn)行培養(yǎng),，目標(biāo)菌應(yīng)呈現(xiàn)良好生長(zhǎng),，并有典型的菌落外觀(guān)、大小和形態(tài),，非目標(biāo)菌應(yīng)是微弱生長(zhǎng)或無(wú)生長(zhǎng),。
總之，培養(yǎng)基的質(zhì)量是微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的基礎(chǔ),，事關(guān)檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性,、可靠性，在微生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作中舉足輕重,。如果在工作中忽視任何一個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量問(wèn)題,，都將導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果科學(xué)性、客觀(guān)性的偏離,。因此,，加強(qiáng)培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，認(rèn)真地做好培養(yǎng)基的質(zhì)控工作,，不斷完善和提高培養(yǎng)基的質(zhì)控水平,，才能為微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供高質(zhì)量的培養(yǎng)基。