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酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）實(shí)驗(yàn)操作重點(diǎn)之一加樣解讀
閱讀：546 發(fā)布時(shí)間：2025-1-7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法,，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種,，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。
ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定操作簡(jiǎn)單,，一般涉及到樣本的收集保存,、試劑準(zhǔn)備、加樣,、溫育,、洗板、顯色,、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面,，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣,、溫育和洗板等步驟為甚,。
一、ELISA實(shí)驗(yàn)加樣過(guò)程：
ELISA實(shí)驗(yàn)中一般需要 4 次加樣,，即加樣本,、加檢測(cè)抗體、加底物和加終止液,。
ELISA加樣
● 實(shí)驗(yàn)室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正,。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會(huì)導(dǎo)致最后讀數(shù)差別,，因此避免儀器帶來(lái)誤差,。
● 加樣前，溶液充分混勻,，加樣時(shí)不可90度向孔中滴加液體,，否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上,，加樣不準(zhǔn)確,。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入,。
● 加樣品時(shí),，單孔用量要求：≥50ul/指標(biāo)，如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo),。如果樣本量不充足,，具體用量可咨詢您的專屬銷售。
● 加樣時(shí)速度不可過(guò)快,，否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性,。
● 加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出,，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干,，并做相應(yīng)記錄。
● 每次加樣順序一致，尤其底物,、終止液順序一致,，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。
● 加完顯色液后,，放入一個(gè)可推拉的抽屜內(nèi),，就可以避光振蕩了。
二,、ELISA實(shí)驗(yàn)加樣技巧：
● 用一張寫滿字的紙,，字越多越好，比如報(bào)紙,，墊在下面,，這樣，加過(guò)標(biāo)本的小孔看過(guò)去下面的字會(huì)變小,，沒(méi)加的字正常,，非常容易區(qū)分。
● 可以利用液面反光與沒(méi)有加的孔加以區(qū)別,。
三,、ELISA實(shí)驗(yàn)加樣問(wèn)題解答：
以下問(wèn)題可能因多種原因引起，本文僅討論加樣的解決方法：
Q： 同一個(gè)樣本間的各個(gè)復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異,？
A： 加樣量多少不一,，操作時(shí)間長(zhǎng)短不一。重復(fù)同一樣本時(shí),，加樣量與加樣時(shí)間理應(yīng)相同,，同時(shí)也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動(dòng)酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合,。
Q： 陽(yáng)性對(duì)照讀數(shù)不正常,？
A： 加樣量不正確。應(yīng)保持每次加樣的步驟不要有太大的差異,，有條件的應(yīng)該考慮使用排槍,。
Q： 血清本底高？
A： 加樣時(shí)使用同一槍頭,、交叉污染,。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭,，避免交叉污染,。
Q： 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差？
A： 1. 可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn),；孔間不一致,；校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密,；重復(fù)某一樣品時(shí),，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近；重復(fù)測(cè)定標(biāo)本,，操作條件,、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性,；樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,。
2. 可能原因：加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染,；重復(fù)測(cè)定標(biāo)本,，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,，以排除這些因素造成的不一致的可能性,；加樣不要過(guò)快。
3. 可能原因：加錯(cuò)樣本,；檢查記錄和試劑,，是否加錯(cuò)樣本。
4. 可能原因：加樣本及試劑時(shí),，加在孔壁上部非包被區(qū),；加樣槍頭不要貼壁。