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酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實驗操作重點之一加樣解讀
閱讀：759 發(fā)布時間：2025-1-7 酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,，ELISA）是免疫學和分子生物學中廣泛使用的實驗室技術(shù)。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理,，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法,，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別,，信號輸出和數(shù)據(jù)處理,。
ELISA實驗測定操作簡單，一般涉及到樣本的收集保存,、試劑準備,、加樣、溫育,、洗板,、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面,，其中任一步驟的不當都會影響測定結(jié)果,，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚,。
一,、ELISA實驗加樣過程：
ELISA實驗中一般需要 4 次加樣，即加樣本,、加檢測抗體,、加底物和加終止液,。
ELISA加樣
● 實驗室使用的微量加樣器應注意保養(yǎng)并定期校正,。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會導致最后讀數(shù)差別,，因此避免儀器帶來誤差,。
● 加樣前，溶液充分混勻,，加樣時不可90度向孔中滴加液體,，否則會導致液體殘留在吸頭上，加樣不準確,。正確加樣方法應為45度,，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。
● 加樣品時,，單孔用量要求：≥50ul/指標,，如需要做復孔則所需樣本量≥100ul/指標。如果樣本量不充足,，具體用量可咨詢您的專屬銷售。
● 加樣時速度不可過快,，否則無法保證微量加樣的準確性和均一性,。
● 加樣時避免液體濺出,，如有樣本濺出,，應用吸水紙輕輕拭干,，并做相應記錄,。
● 每次加樣順序一致，尤其底物,、終止液順序一致,，保證每個孔顯色時間相同,。
● 加完顯色液后,，放入一個可推拉的抽屜內(nèi)，就可以避光振蕩了,。
二,、ELISA實驗加樣技巧：
● 用一張寫滿字的紙,，字越多越好,，比如報紙,，墊在下面，這樣,，加過標本的小孔看過去下面的字會變小,，沒加的字正常,，非常容易區(qū)分,。
● 可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別,。
三,、ELISA實驗加樣問題解答：
以下問題可能因多種原因引起,，本文僅討論加樣的解決方法：
Q： 同一個樣本間的各個復孔的讀數(shù)有顯著性差異？
A： 加樣量多少不一,，操作時間長短不一。重復同一樣本時，加樣量與加樣時間理應相同,，同時也應注意移液器的校準,。加樣后可輕微晃動酶標板使反應液充分混合,。
Q： 陽性對照讀數(shù)不正常,？
A： 加樣量不正確。應保持每次加樣的步驟不要有太大的差異，有條件的應該考慮使用排槍。
Q： 血清本底高？
A： 加樣時使用同一槍頭,、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭,，做到一樣一吸頭,，避免交叉污染。
Q： 實驗的標準曲線和測定的重復性差,？
A： 1. 可能原因：加樣本及試劑量不準,；孔間不一致；校正移液器,，吸嘴要配套,，裝吸嘴時要緊密,；重復某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近,；重復測定標本,，操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,，以排除這些因素造成的不一致的可能性；樣品稀釋前應充分混勻,。
2. 可能原因：加樣過快,，孔間發(fā)生污染；重復測定標本，操作條件,、人員等應盡可能與上次保持一致,，以排除這些因素造成的不一致的可能性,；加樣不要過快,。
3. 可能原因：加錯樣本,；檢查記錄和試劑,，是否加錯樣本。
4. 可能原因：加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)；加樣槍頭不要貼壁,。