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      PCR反應的物質(zhì)主要包括模板DNA,、引物,、dNTPs,、Taq DNA聚合酶和Mg2+濃度。這些物質(zhì)在PCR反應中發(fā)揮著至關重要的作用,。
1.引物
引物是PCR特異性反應的關鍵,，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度：15-30bp,，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度：以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。
⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,，應嚴格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為宜。引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。
2.酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,，另一種為大腸菌合成的基因工程酶,。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增,，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少,。
3.dNTP的質(zhì)量與濃度
dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,，dNTP粉呈顆粒狀,，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,，使用時應配成高濃度后,，以1M NaOH或1M Tris-HCL緩沖液將其pH值調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝,，-20℃冰凍保存,。多次凍融會使dNTP降解。
在PCR反應中,，dNTP應為50～200umol/L,，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)。當其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),，就會引起錯配,。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,，使游離的Mg2+濃度降低,。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量與純化程度是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理樣本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀,；
蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與CHCl₃抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份,，用乙醇或異丙醇沉淀核酸,。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,，可采用快速簡便的方法溶解細胞,，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,，直接用于PCR擴增,。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA,。
5.Mg2+濃度
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,。在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時,，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜,。Mg2+濃度過高，反應特異性降低,，出現(xiàn)非特異擴增,；濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少,。
綜上所述,，PCR反應的物質(zhì)主要包括模板DNA、引物,、dNTPs,、Taq DNA聚合酶和Mg2+。這些物質(zhì)的質(zhì)量和選擇對于PCR反應的成功與否具有重要影響,。