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細胞冷凍實驗重點事項
閱讀：236 發(fā)布時間：2024-12-3細胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中,，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準備工作方面都需大量的耗費,，而且細胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng),，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要,。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久,；細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃,，理論上儲存時間是無限的,。
一、實驗原理：
隨著溫度降低,，細胞內的酶活性會逐漸降低,，到-70℃左右，酶活性幾乎為0,，代謝活動停止,，可以實現(xiàn)長期保存。然而,，隨著溫度降低,，細胞內外的水分也會“結冰"并形成冰晶，冰晶能導致細胞內發(fā)生機械損傷,、電解質升高,、滲透壓改變、脫水,、pH改變,、蛋白變性等，能引起細胞死亡,。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）,。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點,，延緩凍存過程,，同時增加細胞膜的通透性,，提高細胞內離子濃度，減少細胞內冰晶的形成,，從而達到保護細胞的目的,。
二、實驗步驟
1. 制備凍存液,，凍存液比例：本實驗室采用70%基礎培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO,，不同實驗室及不同細胞可能略有差異，也可采用55%基礎培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO,；
2. 取形態(tài)良好,，處于對數(shù)生長期的細胞，對其消化,、離心 (1500rpm離心8min),、計數(shù)；
3. 根據(jù)細胞數(shù)量加入對應的凍存液,，使細胞密度維持在300-500w/mL；
4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋,，每管分裝1-1.5mL含細胞的凍存液,，擰緊蓋管，做好標記,。
5. 分裝好的凍存管轉入程序降溫盒后直接放-80℃過夜,；
6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜,，注意轉移過程中要保冷,，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；
7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉移到液氮長期保存,。
三,、注意事項：
1. 為保持細胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法,。
2. 凍存物距液氮面越近溫度越低,。標準的低凍速度為－1℃~12℃/分鐘，當溫度下降達－25℃時,，下降速度可增至－5~－10℃/分鐘,，到－100℃時則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度,，過快能影響細胞內水分透出,，太慢則促冰晶形成。
3. 初次凍存者在下降凍存時,，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置,，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法,，以觀測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關系,，當已掌握以上各參數(shù)和凍存技術熟練后,，僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果。
4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣,；上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些,，骨髓干細胞－2~－3℃/分鐘合適；胚胎細胞耐受性較小,，不宜太快,。總之在一開始時,，下降速度不能超過－10℃/分鐘,。
5. 用什么防護劑合適和用量多大，要依細胞而定,，初代培養(yǎng)細胞用DMSO 較好,，一般細胞可用甘油；用量以較小為好,。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在20%-30%甘油中很好,。
6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見,，凍存一年后,，應再復蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存,。
7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時,，要做好防護工作，以免凍傷
8. 注意自身的安全,，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心,。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,，小心有毒性試劑例如DMSO,，并避免尖銳物品傷人等。