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逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)操作重點(diǎn)干貨分享
閱讀：684 發(fā)布時(shí)間：2024-11-25逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過(guò)程,，即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種,，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）,。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對(duì),，可合成全長(zhǎng)的 cDNA,，但僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA ，對(duì)模板質(zhì)量要求高,，較適合克隆實(shí)驗(yàn),。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基，可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合,，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板,，但特異性低，小片段多,，適合后續(xù) qPCR 實(shí)驗(yàn),。基因特異性引物可以識(shí)別特定模板序列,，具有特異性強(qiáng),，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列,。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇,。
2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成,，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的 RNaseH 活性,，它最適溫度是42℃,，最適 pH8.3，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙,，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度,。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的,，有 RNA 聚合酶活性和相對(duì)較弱的 RNaseH 活性,，最適溫度37℃，最適 pH7.6,，較弱的 RNaseH 活性對(duì)獲得2-3kb的 mRNA 的全長(zhǎng) cDNA 有很大好處,。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，要求A260/280=1.9~2.1,，A260/230=2.0~2.2,。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品）,，28S rRNA 條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA 條帶的兩倍,，并且無(wú) gDNA 和蛋白殘留。
上面給大家簡(jiǎn)單介紹了一下逆轉(zhuǎn)錄的3大要素,，除此之外在實(shí)際的操作過(guò)程中,，還會(huì)有各種各樣的讓問(wèn)題我們措手不及，下面給大家一一詳細(xì)解答,！
1. 如何提高 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏度與特異性,？
① 確定模板 RNA 完整性好，無(wú) DNA 污染,。
② RNA 模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑,。
③ 使用適量的模板 RNA ，模板量太多會(huì)降低特異性,，太少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱,。
④ 若模板中有二級(jí)結(jié)構(gòu)，可通過(guò)提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來(lái)提高擴(kuò)增效果,。
2. RNA 中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí),，怎么處理？
逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS ,、EDTA ,、甘油、焦磷酸鈉,、亞精胺和胍鹽等等,。可將已確定的高質(zhì)量 RNA 模板同樣品混合，同高質(zhì)量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測(cè) RNA 抑制劑,；若高質(zhì)量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低,，則說(shuō)明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對(duì) RNA 沉淀進(jìn)行清洗,，以除去抑制劑,。
3. 逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。
① RNA 模板質(zhì)量差,，需要重新制備 RNA 模板,，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。
② 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分,，可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,，所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來(lái)說(shuō)可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好）,。
③ 起始的 RNA 模板量低,，需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。
④ 基因本身原因（復(fù)雜和長(zhǎng)度）,，可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因的引物,，避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)?；蛘哂萌椒ǔ绦蚧蜓娱L(zhǎng)兩步法程序的延伸時(shí)間,。
⑤ 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差，可以通過(guò)做平行不用品牌產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn),，對(duì)比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能,。
4. 逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增效率評(píng)估，應(yīng)該關(guān)注哪些指標(biāo),？
建議： qPCR-ct 值,，或者 PCR 產(chǎn)量
如果想比較逆轉(zhuǎn)錄性能,，最為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對(duì)比實(shí)驗(yàn),，這種方法相對(duì)較為準(zhǔn)確。
不建議：cDNA 中間產(chǎn)物濃度測(cè)定 or 其他方法,。
逆轉(zhuǎn)錄完成后是不建議測(cè)定產(chǎn)物濃度的,，由于逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈，溶液中的 RNA 和部分 DNA 會(huì)對(duì)吸光值產(chǎn)生影響,，所以測(cè)定出來(lái)的產(chǎn)物濃度并不準(zhǔn)確,，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，由于不同品牌之間的逆轉(zhuǎn)錄體系具有或多或少的差異,，其體系中的各種離子等都能對(duì)吸光度產(chǎn)生影響,，所以測(cè)定的結(jié)果也沒(méi)有可比性。
優(yōu)化及注意事項(xiàng)：
① 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 時(shí),，提取 RNA 是關(guān)鍵,，需分離高質(zhì)量 RNA（純度和完整性）,。
② 整個(gè)操作過(guò)程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材,。
③ 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中要謹(jǐn)防 RNA 酶的污染,，加入 RNA 酶抑制劑。
④ 為了防止非特異性擴(kuò)增,，必須設(shè)陰性對(duì)照,。
⑤ 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)應(yīng)全程在冰上操作完成，操作過(guò)程應(yīng)避免 RNase 污染,。
⑥ 提高逆轉(zhuǎn)錄預(yù)熱溫度（也可根據(jù)相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行調(diào)整）,。
⑦ 減少基因組 DNA 污染，可使用去基因組的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,。