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實(shí)時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實(shí)驗步驟
閱讀：1373 發(fā)布時間：2024-9-29實(shí)時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實(shí)時擴(kuò)增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù),。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴(kuò)增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號,，從而可以對目標(biāo)序列進(jìn)行量化,。RT-qPCR 通常用于基因表達(dá)分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用,。
RT-qPCR原理的三個主要步驟：
1 反轉(zhuǎn)錄：
使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。
該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。
反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物,。
2 PCR擴(kuò)增：
使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域,。
PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量,。
PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針,，它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。
3 熒光實(shí)時檢測：
使用實(shí)時PCR儀器實(shí)時監(jiān)測熒光信號,。
熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例,。
使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù),。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量,，從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。
實(shí)驗步驟：
1,、RNA提?。篟NA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。
A,、離心機(jī)4℃預(yù)冷,，準(zhǔn)備試劑：氯仿、異內(nèi)醇,、75%乙醇（用DEPC水配制）,、無RNase的水或DEPC水、無酶吸頭及試管,，戴口罩,、帽子、無粉乳膠手套,；
B,、取出轉(zhuǎn)染建模成功24h后的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液,，用1×PBS清洗1次,；
C、每10cm2生長的細(xì)胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細(xì)胞使其全脫落,；
D,、用移液槍反復(fù)吹吸裂解液直至無明顯沉淀，將裂解液全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的1.5mL EP管中,，室溫靜置5min,；
E、往每個EP管中加0.2mL氯仿（Transzol Up體積的1/5）,，混勻振蕩30s,，室溫靜置3min；
F,、4℃條件下10000g離心15min,，離心后RNA主要分布在上層水相中,，體積約50%；
G,、轉(zhuǎn)移上層水相于新的EP管中（約400μL,，注意不要吸取到下層），每管加入0.5mL異丙醇 （Transzol Up體積的1/2）,，顛倒混勻，室溫孵育10min,；
H,、4℃下10000g離心10min后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀，吸棄上清,，加1mL 75%乙醇吹懸沉淀,；
I、4℃下7500g離心5min后棄上清,，盡量吸凈,，室溫晾干沉淀5min，依細(xì)胞量加入30~100μL的RNA溶解液,；
K,、55℃~60℃金屬浴10min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2,、cDNA合成：見上文
3,、qPCR：按表2.6，在ABI熒光定量PCR儀專用96孔板中建立qPCR反應(yīng)體系,，反應(yīng)程序為兩步法（表2.11）
4,、RT-qPCR統(tǒng)計：每個基因在不同組別中的表達(dá)在獲得3個重復(fù)的Ct值后，從ABI系統(tǒng)中拷貝原始數(shù)據(jù),，挑出“Ct SD"值大于0.5的組別（需重新實(shí)驗）,，求出各個組的管家基因GAPDH的均值（一般相差1個Ct值以內(nèi)），再依次求出實(shí)驗組和對照組與各自的GAPDH之間的Ct差值,，即得到第一個ΔCt,，隨后求出實(shí)驗組ΔCt和對照組ΔCt的差值，即可得到第二個ΔCt（ΔΔCt）,，最后使用2 -ΔΔCt法求出實(shí)驗組相對于對照組的Ct值變化倍數(shù)（實(shí)驗組2 -ΔΔCt/對照組2 -ΔΔCt=實(shí)驗組2 -ΔΔCt/2 0=實(shí)驗組2 -ΔΔCt）,。將3組實(shí)驗組數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad 9.0，輸入對照組數(shù)據(jù)為1,，使用Student's t或ANOVA進(jìn)行假設(shè)檢驗,，p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。