化工儀器網
技術文章
細胞培養(yǎng)（cell culture）過程出現問題解答
閱讀：362 發(fā)布時間：2024-9-14細胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內環(huán)境（無菌,、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存,、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法,。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術,，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術。
不論對于整個生物工程技術,，還是其中之一的生物克隆技術來說,，細胞培養(yǎng)都是一個重要的過程，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)?？寺?。細胞培養(yǎng)技術可以由一個細胞經過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術關鍵的環(huán)節(jié),，而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆,。
細胞培養(yǎng)技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞,，又可以借此研究細胞的信號轉導,、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等,。
細胞培養(yǎng)總會遇到細胞污染,、胞質疏松，狀態(tài)不好,，養(yǎng)不起來等等問題,。接下來就給你們介紹一些常見問題解決方法。
細胞培養(yǎng)過程出現問題解答如下：
1.冷凍管應如何解凍,？
取出冷凍管后,，須立即放入37 °C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,，必須注意安全,，預防冷凍管之爆裂。
2. 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,，是否應馬上去除DMSO,？
除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）,，在解凍之后,，可直接放入10-15ml新鮮培養(yǎng)基,，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題,。
3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,，細胞可能無法立即適應，導致細胞狀態(tài)不好甚至死亡,。
4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清,？
不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響,。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活,。
5. 培養(yǎng)細胞時應使用多少濃度的CO2？5%還是10%,，或根本沒有影響,？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度,。當培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時,，細胞培養(yǎng)時應使用10% CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時,，則應使用5% CO2 培養(yǎng)細胞,。
6. 何時須更換培養(yǎng)基？
視細胞生長密度而定,，或遵照細胞株基本數據上之更換時間,，按時更換培養(yǎng)基即可。
7. 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素,？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外,，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素,，但實際操作中有時會加入1%的青鏈霉素來避免細菌污染,。
8. 貼壁細胞繼代時該使用多少濃度的trypsin-EDTA？
一般使用濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA·4Na,。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,，保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低,，并可減少污染之機會,。
9. 懸浮細胞應如何繼代處理,？
一般僅需在原培養(yǎng)瓶中持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基，稀釋細胞濃度即可,，若培養(yǎng)液太多,，可將培養(yǎng)瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止,。分瓶時取出一部份含細胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度,，重復前述步驟即可,。
10. 一般動物細胞的離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞,，其離心速率一般為300 g (約1,000 rpm),，5-10分鐘，過高轉速將造成細胞死亡,。
11. 合適的細胞接種密度是多少,？
依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦可能會導致細胞生長過慢,。
12. 細胞冷凍培養(yǎng)基的成份是哪些,？
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和90-95 %原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能,，故不可將DMSO直接加入細胞液中,，必須使用前先行配制完成、且需提前放在4 °C預冷,。
13. DMSO的等級和無菌過濾方式,？
冷凍保存使用的DMSO等級必須為Tissue culture grade，其本身即為無菌狀況,，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,，避光保存。若要過濾DMSO,，則須使用耐DMSO的Nylon材質濾膜,。
14. 細胞凍存的步驟是什么？
凍存方法一：冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。
凍存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C至–80 °C以下,，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時,，以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,，但存活率會降低,。
15. 凍存時細胞密度為多少比較合適,？
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106cells/ml vial為宜,。
16. 應如何避免細胞污染,？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌,、霉菌,、病毒和霉?jié){菌。造成細胞污染的主要原因有無菌操作技術不當,、操作室環(huán)境不佳,、實驗耗材污染、血清污染和細胞來源污染等,。嚴格的無菌操作技術,、清潔的環(huán)境和品質良好的細胞來源是避免污染的最好方法。
17. 如果細胞發(fā)生微生物污染時,，應如何處理,？
直接滅菌后丟棄之。
18. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響,？
支原體污染幾乎可影響細胞所有的生長參數,。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free,，實驗結果方有意義,。
19. 偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理,？
直接滅菌后丟棄是好的方法,，以避免污染其它細胞株。但如果樣品比較珍貴,，可以購買市面上現有的支原體去除試劑,，嘗試拯救一下。
20. CO2培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔,？
定期更換無菌蒸餾水或無菌去離子水(至少每兩周一次),。
21. 為何培養(yǎng)基保存于4 °C冰箱中，顏色會偏暗紅色,，且pH值會越來越偏堿性,？
培養(yǎng)基保存在4 °C冰箱中， 培養(yǎng)基內的CO2會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。
22. 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同,？
不同廠牌的dish或flask,，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同,，但對大部分細胞沒有太大之影響,，只有少數細胞可能會因使用不同廠牌的dish或flask而表現出生長差異。
23. 購買的細胞冷凍管經解凍后,，為何會發(fā)生細胞數目太少的情形,？
研究人員在解凍細胞后出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤,，造成細胞的物理性損傷,，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,，待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
24. 購買的細胞出現死亡率高或狀態(tài)不佳的可能原因,？
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現存活率不佳,，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳,。解凍過程錯誤,。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心,。懸浮細胞誤認為死細胞,。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C太久,。