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ELISA試驗(yàn)定性測(cè)定方法分析
閱讀：337 發(fā)布時(shí)間：2024-9-9ELISA定性測(cè)定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出 "有"或"無(wú)"的簡(jiǎn)單回答,，分別用"陽(yáng)性",、"陰性"表示,。"陽(yáng)性"表示該標(biāo)本在該測(cè)定系統(tǒng)中有反應(yīng),。"陰性"則為無(wú)反應(yīng),。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果,，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度,，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測(cè)定中,，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn),，呈陽(yáng)性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱,，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性,、弱陽(yáng)性具定量意義。在間接法和夾心法 ELSIA中,，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔,。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔,。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同,，分述如下。
1,、 間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷,。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性，顯色清晰者為陽(yáng)性,。但在 ELSIA中,，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底,，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異,，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物,。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí),，宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的指標(biāo)。目視法簡(jiǎn)捷明了,，但頗具主觀性,。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值,，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù),。先讀出標(biāo)本（sample，S）,、陽(yáng)性對(duì)照（P）,、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算,。計(jì)算方法有多種,，大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。
a. 陽(yáng)性判定值
陽(yáng)性判定值（cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù),，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn),。
用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,，陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,，須配用的儀器,，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測(cè) HBsAg的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml,。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照,。測(cè)得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400）,，試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,，并≤1.5×NCX,，如其中之一超出此范圍，則棄去,，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX,；如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效,。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：
陽(yáng)性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本 A值＞陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性，小于陽(yáng)性判定值的為陰性,。應(yīng)注意的是,，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下,，而不是對(duì)各種試劑均可通用,。
根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用,，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生"試驗(yàn)無(wú)效"的后果,。
b. 標(biāo)本/陰性對(duì)照比值
在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適,。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對(duì)照（N）的A值后,，計(jì)算S/N值。也有寫作P/N的,，這里的P不代表陽(yáng)性(positive),，而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解,。為避免混淆,，宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中,，有些作者定出S/N為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),，現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。應(yīng)注意的是,，N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多,。因此,，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值）,，則按0.05計(jì)算,，否則將出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
2,、 競(jìng)爭(zhēng)法
在競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA中,，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競(jìng)爭(zhēng)抑制物的量,，一般調(diào)節(jié)陰性對(duì)照的吸光度在1.0-1.5之間,，此時(shí)反應(yīng)為敏感。
競(jìng)爭(zhēng)法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果,，因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異,，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S,、P和N的吸光值,。計(jì)算方法主要也有兩種，即陽(yáng)性判定值法和抑制率法,。
a. 陽(yáng)性判定值法
與間接法和夾心法中的陽(yáng)性判定值法基本相同,，但在計(jì)算公式中引入陽(yáng)性對(duì)照 A值，現(xiàn)舉某種檢測(cè)抗HBc的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對(duì)照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿,，陽(yáng)性對(duì)照中抗HBc含量為125±1 00u/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照,。測(cè)得A值后,，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均值（NC X ）和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗(yàn)才有效,。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)小于2.000,，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍,，則棄去,，而以另2個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算×NCX；如有2個(gè)陰性對(duì)照A超出以上范圍,，則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效,。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算：
陽(yáng)性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標(biāo)本A值≤陽(yáng)性判定值的反應(yīng)為陽(yáng)性,，A＞陽(yáng)性判定值的反應(yīng)為陰性。
b. 抑制率法
抑制率表示標(biāo)本在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合中標(biāo)本對(duì)陰性反應(yīng)顯色的抑制程度,，按下式計(jì)算：
抑制率（%）= （陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）×/陰性對(duì)照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽(yáng)性,，＜50%為陰性。