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實時熒光定量PCR技術(shù)必看干貨小結(jié)
閱讀：377 發(fā)布時間：2024-9-2實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,，Real-time qPCR),，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,。通常我們會重點關(guān)注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。其原理如下：
1、TaqMan熒光探針：
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步。
2,、SYBR熒光染料：
在PCR反應(yīng)體系中,，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號,，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步,。
熒光染料也稱DNA結(jié)合染料,，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合,，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號,，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加,。隨PCR產(chǎn)物的增加,，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量,。
我們將這條熒光擴增曲線人為地分為基線期,、指數(shù)擴增期和平臺期三個階段:
1、基線期,，擴增的熒光信號被熒光背景信號所覆蓋,，我們無法判斷熒光強度的變化。
2,、擴增期,，熒光信號呈指數(shù)增長,，擴增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系，在此階段可定量分析,。
3,、平臺期，由于底物耗盡等因素.熒光信號不再呈指數(shù)增加,。
RT-qPCR原理的三個主要步驟：
1 反轉(zhuǎn)錄：
使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。
該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。
反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物,。
2 ,、PCR擴增：
使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環(huán)繞目標區(qū)域,。
PCR是一個循環(huán)過程,，呈指數(shù)級擴增DNA模板的數(shù)量。
PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針,，它們結(jié)合到擴增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號,。
3 、熒光實時檢測：
使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號,。
熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴增的DNA數(shù)量成比例,。
使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù),。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量,，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
實時熒光定量PCR技術(shù)中有幾個重要的概念,，包括擴增曲線,、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù),。
1,、擴增曲線（amplification curve）:
是在實時熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應(yīng)過程中,，通過檢測系統(tǒng)對PCR管內(nèi)的樣品進行實時檢測,，最后將熒光信號值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期,、指數(shù)增長期,、線性增長期、平臺期,。
2,、基線（baseline）：
是背景曲線的一段，在擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里熒光信號變化不大,，接近一條直線,。
3、熒光閾值（threshold）：
是在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準）,。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期,。
4、閾值循環(huán)數(shù):
表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),，研究表明,，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多,，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大,。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標,CT值為縱坐標的一條標準曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標準曲線上計算出該模板的起始拷貝數(shù),。