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免疫熒光技術(shù)具體操作過程陳述
閱讀：679 發(fā)布時(shí)間：2024-7-22免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量,。
1,、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,，易使抗原彌散,。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,，防止裂片和脫片嚴(yán)重,。
2、組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min,尤其要較長時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存,。
3,、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉,，減弱背景著色,。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min.
4,、一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要,，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度,、室溫,、37度，其中4度 效guo 最好,；孵育時(shí)間：這與溫度,、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h,而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min.具體條件還要摸索,。
5,、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液,，若是濃縮液還要摸索濃度,，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下,，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間,。最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長,，可能后有大量的游離熒光素殘留,，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。
6,、復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓,，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染,。
7,、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片,，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液,。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,，然后一手拿住蓋片某一拐角,，而另一手拿對面的那個(gè)拐角,，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止,；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí),，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡,。
8,、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要,，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.注意（1）單獨(dú)沖洗,，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗,，防止切片的脫落,。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時(shí)間要足夠,，才能徹di洗去結(jié)合的物質(zhì),。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn),，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸,，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M.（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成,，而酸性條件則有利于分解,；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）,。
9,、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照,，也要封好片和用指甲油封固,，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,，不要隨意改變程序,；應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對眼睛的損害,，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡,；檢查時(shí)間每次以1~2h為宜，超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,，熒光減弱,；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時(shí)間的照射,，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象,；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限,，標(biāo)本應(yīng)集中檢查,，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源,。天熱時(shí),，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間,。燈熄滅后欲再啟用時(shí),，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源,。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后,；標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱,。若將標(biāo)本放在聚yi烯塑料袋中4℃保存,，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā),；使用的玻片等載體,，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光,，如果使用油鏡,，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器,，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命,，也會(huì)影響鏡檢的效果。