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閱讀：389 發(fā)布時(shí)間：2024-7-8
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計(jì),，酶的質(zhì)量。模板的制備,，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下,，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能,，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗,。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶,、脂肪等),。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量,。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來(lái)破壞細(xì)胞組份,，溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性,，再用蛋白酶K來(lái)消化去除蛋白質(zhì),，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提,，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸,，供PCR實(shí)驗(yàn)用。但近幾年來(lái)也發(fā)展了些 簡(jiǎn)便實(shí)用較為有效的標(biāo)本消化處理方法,。亦可滿足PCR實(shí)驗(yàn)的要求,。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本，視PCR實(shí)驗(yàn)的目的(是科研還是檢測(cè))及環(huán)境條件而定,。
模板核酸的提取制備方法:
一,、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳,。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛,、毛發(fā)、精斑,、血液(血清,、血漿、全血)局部分泌 物,、尿,，糞便等。
1,、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,，臨用時(shí)加入消化液中,。
2、提取方法:
有些標(biāo)本,、在用蛋白酶K消化前,，還需預(yù)處理一下，如糞便,、分泌物,、痰液、組 織塊,、石蠟包埋組織等,，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等,。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻,，55℃1～3小時(shí)， 或37℃過(guò)夜,。加等體積的飽和酚抽提1～2次,，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,，加入2.5倍體積的冰冷無(wú)水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清,，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清,，真空或37℃溫箱或室溫干燥,，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴(kuò)增,，或放-20℃保存,。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本,，經(jīng)離心處理 后,，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增,。 如雜質(zhì)較多,，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng),。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響,，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性,。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高,。
二,、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞,，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20),，95～98℃,，15～30min以裂解病原體，裂解細(xì)胞,。然后12000r/min離心5～10min,，取上清20～30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液,，加熱處理離心后PCR擴(kuò)增,。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理,，離心取上清,，PCR擴(kuò)增檢測(cè)HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul,，加入1mol/L NaOH 20ul,，37℃30min，離心,，加 1mol/L HCl 20ul,，離心后，取上清5ul,，用于PCR擴(kuò)增,。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h,，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR,，其特異性和敏感性較前法 更好。
四,、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過(guò)的組織細(xì)胞,，分泌物及血液標(biāo)本，加適量無(wú)菌蒸餾水或PBS,，混勻 后,，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min,，取上清做PCR.
五,、碘化鈉法: 取組織細(xì)胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI,，反復(fù)輕混 20s,，加等體積:(49:1)振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇，混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min,，沉淀加10～100ul,，TE溶解，取5～10ul做PCR,，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,，0.5%十二烷基肌酸鈉，10ug糖原,，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,，13mmol/LEDTA)混勻后，60℃15min,，加等體積異丙醇,，離心沉定 后，加TE液用于PCR擴(kuò)增,，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高,。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取,。標(biāo)本為組織細(xì)胞及血清等,。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2,、消化方法: 用50～100ul細(xì)胞懸液及血清,，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后，或65℃1小時(shí),，或室溫放置數(shù)分鐘,，然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液，再加等體積的酚:,，用力振搖約10s,，10000r/min，離心5min,，取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后,，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～ 2次,，真空干燥,，沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存,。
其它消化處理標(biāo)本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法,。③Chelex-100法。④全血直接擴(kuò)增法⑤尿素消化裂解法,。各有千秋,，可根據(jù)情況選用。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計(jì),，酶的質(zhì)量。模板的制備,，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下,，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能,，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗,。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶,、脂肪等),。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量,。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來(lái)破壞細(xì)胞組份,，溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性,，再用蛋白酶K來(lái)消化去除蛋白質(zhì),，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提,，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸,，供PCR實(shí)驗(yàn)用。但近幾年來(lái)也發(fā)展了些 簡(jiǎn)便實(shí)用較為有效的標(biāo)本消化處理方法,。亦可滿足PCR實(shí)驗(yàn)的要求,。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本，視PCR實(shí)驗(yàn)的目的(是科研還是檢測(cè))及環(huán)境條件而定,。
模板核酸的提取制備方法:
一,、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳,。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛,、毛發(fā)、精斑,、血液(血清,、血漿、全血)局部分泌 物,、尿,，糞便等。
1,、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,，臨用時(shí)加入消化液中,。
2、提取方法:
有些標(biāo)本,、在用蛋白酶K消化前,，還需預(yù)處理一下，如糞便,、分泌物,、痰液、組 織塊,、石蠟包埋組織等,，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等,。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻,，55℃1～3小時(shí)， 或37℃過(guò)夜,。加等體積的飽和酚抽提1～2次,，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,，加入2.5倍體積的冰冷無(wú)水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清,，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清,，真空或37℃溫箱或室溫干燥,，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴(kuò)增,，或放-20℃保存,。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本,，經(jīng)離心處理 后,，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增,。 如雜質(zhì)較多,，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng),。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響,，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性,。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高,。
二,、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞,，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20),，95～98℃,，15～30min以裂解病原體，裂解細(xì)胞,。然后12000r/min離心5～10min,，取上清20～30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液,，加熱處理離心后PCR擴(kuò)增,。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理,，離心取上清,，PCR擴(kuò)增檢測(cè)HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul,，加入1mol/L NaOH 20ul,，37℃30min，離心,，加 1mol/L HCl 20ul,，離心后，取上清5ul,，用于PCR擴(kuò)增,。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L，37℃1h,，再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR,，其特異性和敏感性較前法 更好。
四,、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過(guò)的組織細(xì)胞,，分泌物及血液標(biāo)本，加適量無(wú)菌蒸餾水或PBS,，混勻 后,，100℃煮沸10～15min，14000r/min 10min,，取上清做PCR.
五,、碘化鈉法: 取組織細(xì)胞及抗凝血液10～100ul，加等體積的6MNaI,，反復(fù)輕混 20s,，加等體積:(49:1)振勻后，離心取上清加0.6體積的異丙醇，混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min,，沉淀加10～100ul,，TE溶解，取5～10ul做PCR,，亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,，0.5%十二烷基肌酸鈉，10ug糖原,，26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,，13mmol/LEDTA)混勻后，60℃15min,，加等體積異丙醇,，離心沉定 后，加TE液用于PCR擴(kuò)增,，其產(chǎn)量和質(zhì)量較高,。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取,。標(biāo)本為組織細(xì)胞及血清等,。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2,、消化方法: 用50～100ul細(xì)胞懸液及血清,，加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后，或65℃1小時(shí),，或室溫放置數(shù)分鐘,，然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液，再加等體積的酚:,，用力振搖約10s,，10000r/min，離心5min,，取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后,，14000r/min離心15min，沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1～ 2次,，真空干燥,，沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存,。
其它消化處理標(biāo)本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法,。③Chelex-100法。④全血直接擴(kuò)增法⑤尿素消化裂解法,。各有千秋,，可根據(jù)情況選用。