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ELISA檢測(cè)各方法一般操作過(guò)程
閱讀：852 發(fā)布時(shí)間：2024-6-24ELISA檢測(cè)是一種免疫檢測(cè)方法,，通常用于測(cè)量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白,。像其他免疫檢測(cè)法一樣,，它們依靠抗體與目標(biāo)的結(jié)合來(lái)促進(jìn)檢測(cè)。
通常情況下,，ELISA檢測(cè)是在96孔板中進(jìn)行的,，這種形式使其適合于一次篩選許多樣品。血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液、唾液,、組織裂解液和尿液都是用于這些檢測(cè)的常見(jiàn)樣品類(lèi)型,，但理論上大多數(shù)液體樣品類(lèi)型都可以使用。然而,，重要的是要考慮到一些樣品類(lèi)型可能包括抑制性因素,，如共享相似抗原表位的緩沖液成分或可能損害目標(biāo)或檢測(cè)成分的蛋白酶等因素，這些因素可能干擾檢測(cè)的性能,。
有幾種不同的檢測(cè)形式,，但都依賴(lài)于目標(biāo)本身或能夠捕獲目標(biāo)的抗體/抗原與包被板表面的結(jié)合。然后采用測(cè)定步驟,，包括結(jié)合抗原,，或常見(jiàn)的抗體，以使成功的結(jié)合被測(cè)定和量化,，常見(jiàn)的是通過(guò)比色測(cè)定?，F(xiàn)在有四種主要的ELISA類(lèi)型，直接法,、間接法,、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。
同樣的原理也適用于抗體的測(cè)定,，只是抗原和一級(jí)抗體的作用相反,。雖然不同類(lèi)型的ELISA方案有差異，但大多數(shù)檢測(cè)都有一些應(yīng)該考慮一般操作過(guò)程,。
1,、板包被
大多數(shù)ELISA檢測(cè)步是將檢測(cè)的個(gè)成分與包被板結(jié)合。這通常是通過(guò)被動(dòng)吸附完成的,，一個(gè)非特異性的過(guò)程,，所以結(jié)果將取決于涂在包被板上的東西。
如果使用了含有抗原的樣品,，那就需要一個(gè)具有選擇性的包被板,，因?yàn)楦鞣N抗原都會(huì)結(jié)合，而不僅僅是那些感興趣的,。然而,，如果像用于抗體檢測(cè)的ELISA間接法那樣使用純化抗原，或像ELISA夾心法那樣使用捕獲抗體,，那么我們已經(jīng)準(zhǔn)備了一個(gè)具有選擇性的包被板,。
包被板的類(lèi)型大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，其具有不同的結(jié)合特性,，這取決于目標(biāo)物質(zhì)和檢測(cè)的性質(zhì),。一些目標(biāo)物質(zhì),，包括重度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物,、DNA,、脂類(lèi)、短肽和有洗滌劑的蛋白質(zhì),，是不能很好吸附的,。在這些情況下，建議使用經(jīng)過(guò)處理允許共價(jià)連接到表面的包被板,。
2,、孵育
將試劑加入ELISA板后,，必須進(jìn)行孵育,，以便有時(shí)間進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和時(shí)間將取決于檢測(cè)步驟和正在進(jìn)行的操作,。通常在樣品應(yīng)用之后,，與37℃下孵育1小時(shí)。
然而,，像阻斷這樣的步驟可以在冰箱中過(guò)夜,，測(cè)定過(guò)程中的孵育通常在室溫下進(jìn)行，時(shí)間短得多,。
3,、洗滌
洗板是在應(yīng)用在檢測(cè)每個(gè)組成部分之間，直到結(jié)果測(cè)定的一個(gè)重要步驟,。溶液從孔中排空后,，通常使用磷酸鹽緩沖鹽水-20（PBST）做為緩沖液清洗孔，以去除任何殘留的未結(jié)合抗原,、抗體或試劑,。
這可以用多通道移液器手工完成，或使用自動(dòng)洗板機(jī),。
不充分的清洗可能會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào),，而過(guò)多的清洗會(huì)導(dǎo)致樣品信號(hào)低。不一致的清洗可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)板塊的不一致,，從而導(dǎo)致不可靠的結(jié)果,。
4、阻斷
在用蛋白質(zhì)包被ELISA板后,，阻斷通常是必要的,，以防止在接下來(lái)方案步驟中測(cè)定抗體的任何非特異性結(jié)合。
與檢測(cè)無(wú)關(guān)的混合蛋白被添加到板中并進(jìn)行孵育,，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn),。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)阻斷緩沖液選擇包括脫脂干乳,、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。
另外,，非離子洗滌劑,，如Tween 20或Triton X-100，可作為阻斷劑使用,，但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永jiu性阻斷,。無(wú)效的板塊阻斷會(huì)導(dǎo)致背景噪音增加，降低檢測(cè)的靈敏度和特異性,。
5,、抗體
實(shí)驗(yàn)性抗體是大多數(shù)ELISAs的基石，選擇正確的抗體至關(guān)重要,，特別是在使用多種抗體的情況下,。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，它們都有各自的有點(diǎn)和缺點(diǎn),。單克隆抗體提供高特異性,，但成本較高。另一方面,，多克隆抗體可以在多個(gè)結(jié)合點(diǎn)與目標(biāo)結(jié)合,，放大信號(hào)并提高靈敏度。
使用采用二級(jí)抗體的方法增加了額外的步驟,，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間,，增加了出錯(cuò)機(jī)會(huì)，需要多優(yōu)化來(lái)找到合適的兼容抗體對(duì),。然而,，使用多克隆二級(jí)抗體所帶來(lái)的靈敏度提高可能使其成為一種值得或必須的有效檢測(cè)方法發(fā)展方向。
6,、測(cè)定
無(wú)論使用哪種ELISA類(lèi)型,，后一步都是測(cè)定步驟，常見(jiàn)的是利用酶介導(dǎo)的可見(jiàn)顏色變化化學(xué)反應(yīng),，然后可以用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)量,。
酶結(jié)合抗原或抗體被應(yīng)用到測(cè)試孔中，如果目標(biāo)存在,，它就會(huì)與之結(jié)合,。當(dāng)酶的適當(dāng)?shù)孜锉惶砑拥桨话迳蠒r(shí)，它會(huì)引起顏色變化,，與孔內(nèi)結(jié)合的目標(biāo)物的數(shù)量成正比,。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是一種常用共軛物，一般與底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）合作使用,。底物在HRP的作用下變成藍(lán)色,，然后在加入硫酸溶液后變成黃色,，停止反應(yīng)。
然后可以用酶標(biāo)儀（在TMB加入終止液后,，在450nm波段測(cè)定）,，這是一種紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，來(lái)確定每個(gè)孔的吸光度值,，并根據(jù)檢測(cè)設(shè)計(jì)進(jìn)行校正和計(jì)算,，如減去空白孔平均值、技術(shù)重復(fù)平均值或與標(biāo)準(zhǔn)比率計(jì)算,。