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逆轉錄實驗必看重難點分享
閱讀：1229 發(fā)布時間：2024-3-18逆轉錄（reverse transcription）,，是以RNA為模板合成DNA的過程，合成的DNA稱為cDNA,。逆轉錄過程遺傳信息的流動方向為RNA到DNA,，與轉錄過程DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉錄,。
一,、實驗原理要素：
酶促催化使RNA反轉錄為cDNA第一鏈。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交,，然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應互補的cDNA拷貝,，后者能進一步用于PCR擴增。依據(jù)實驗的不同目的,，針對cDNA第一鏈合成的引物可根據(jù)特殊的靶基因設計,，或可用隨機引物與所有mRNA雜交,。
實驗要素：
逆轉錄實驗包括3大要素，分別是引物,、逆轉錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：
逆轉錄引物主要有3種,，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）,。其中 Oligo（dT）具有12-20個 T 堿基,，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長的 cDNA,，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ,，對模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實驗,。而 Random Primers 具有6-9個堿基,，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板,，但特異性低,，小片段多，適合后續(xù) qPCR 實驗,?；蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列，具有特異性強,，靈敏度高的特點,，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實驗需求可進行相應引物的選擇,。
2. 逆轉錄酶：
一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV）,，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性,，它最適溫度是42℃,，最適 pH8.3，在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙,，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長度,。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的,，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性,，最適溫度37℃，最適 pH7.6,，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處,。
3. RNA 模板：
通常利用紫外分光光度計檢測純度,，要求A260/280=1.9~2.1,，A260/230=2.0~2.2,。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品）,，28S rRNA 條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍,，并且無 gDNA 和蛋白殘留。
二,、實驗流程：
1. 實驗前準備
RNA樣品,、逆轉錄試劑盒（以諾唯贊R312為例）
2. 實驗步驟
① 試劑化凍后，用手輕彈混勻后短暫離心,。
② 基因組DNA（gDNA）去除：根據(jù)RNA樣品的濃度按10pg~1μg計算用量,，在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL,，RNA樣品,，總體系為10μL。用移液器吹打混勻后短暫離心,。放入PCR儀,，設置反應條件為42℃ 2min。
③ 第一鏈cDNA合成：根據(jù)上一步反應管的數(shù)量按以下體系在RNase-free離心管中配制預混液：RNase-free ddH2O 5μL,，逆轉錄引物（2μM）1μL,，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL,，用移液器吹打混勻后短暫離心,。在上一步得到的反應管中每管加入10μL，用移液器吹打混勻后短暫離心,。放入PCR儀,，設置反應條件為25℃ 5min，50℃ 15min,，85℃ 5min,。所得cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應或-20℃保存。
三,、注意事項：
1. 防止RNase污染：保持實驗區(qū)域潔凈,；操作時需穿戴干凈的手套、口罩,；實驗所用的離心管,、槍頭等耗材均需保證RNase-free。
2. 反應液的配制要在冰上操作完成,，防止溫度過高造成RNA降解,。
3. cDNA保存時避免反復凍融。
四、常見問題：
1. 逆轉錄后的產(chǎn)物可以測濃度嗎,？
不建議測濃度,，一般評估RNA模板的質(zhì)量，需要從濃度,、純度及完整性三方面進行考量,，但逆轉錄后的產(chǎn)物是一個混合體系，有cDNA,、未全逆轉錄的RNA,、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分,，會干擾cDNA的吸光度,，因此不建議用逆轉錄后的cDNA來檢測濃度與純度。
2. 如何檢測RNA逆轉錄成功與否,？
1) 內(nèi)參法：理論上,，逆轉錄的cDNA是長度不同的DNA片段，所以電泳條帶應該均勻分布在泳道上,，如果RNA豐度低,，電泳檢測也可能無產(chǎn)物，這種情況通過PCR擴增內(nèi)參基因,，如果有擴增產(chǎn)物,，cDNA的質(zhì)量基本上可以保證(少數(shù)情況下：如目的基因片段過長，可能會有例外),。
2) 已知基因擴增法：如果有已知以此模板擴出來的基因,，可以用此基因的引物驗證。能擴增出內(nèi)參,，不一定就說明cDNA沒有問題,，因為內(nèi)參在cDNA中豐度高，容易擴增,。如果cDNA因為各種原因導致部分降解,，則會大大影響低豐度的目的基因的PCR結果，而內(nèi)參因為是高豐度基因,，擴增很可能不受影響,。
3. 逆轉錄產(chǎn)物中存在gDNA對后續(xù)qPCR實驗有何影響？
當cDNA產(chǎn)物中混有gDNA時,，cDNA和gDNA在qPCR反應時會被同時擴增,，無法區(qū)分熒光信號是來自于cDNA還是gDNA，因此定量結果可能會存在偏差,。特別是低表達量的基因,，本身的擴增信號低,，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影響,。在逆轉錄的時候,，加一步gDNA去除的步驟，能夠有效降低gDNA污染的影響,，增加實驗的可信度。