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逆轉(zhuǎn)錄實驗必看重難點分享
閱讀：707 發(fā)布時間：2024-3-18逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）,，是以RNA為模板合成DNA的過程,，合成的DNA稱為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息的流動方向為RNA到DNA,，與轉(zhuǎn)錄過程DNA到RNA的方向相反,，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。
一,、實驗原理要素：
酶促催化使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈,。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交，然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應(yīng)互補的cDNA拷貝,，后者能進一步用于PCR擴增,。依據(jù)實驗的不同目的，針對cDNA第一鏈合成的引物可根據(jù)特殊的靶基因設(shè)計，或可用隨機引物與所有mRNA雜交,。
實驗要素：
逆轉(zhuǎn)錄實驗包括3大要素,，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：
逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種,，包括 Oligo（dT）,、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個 T 堿基,，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對,，可合成全長的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ,，對模板質(zhì)量要求高,，較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基,，可隨機識別模板并結(jié)合,，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低,，小片段多,，適合后續(xù) qPCR 實驗?；蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列,，具有特異性強，靈敏度高的特點,，但需合成特定的序列,。所以根據(jù)不同實驗需求可進行相應(yīng)引物的選擇。
2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：
一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV）,，由兩條肽鏈組成,，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性,，它最適溫度是42℃,，最適 pH8.3，在高反應(yīng)溫度時可消除 mRNA 的二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙,，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長度,。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的,，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性,，最適溫度37℃，最適 pH7.6,，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處,。
3. RNA 模板：
通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2,。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度,，完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強度應(yīng)當大致為18S rRNA 條帶的兩倍,，并且無 gDNA 和蛋白殘留,。
二、實驗流程：
1. 實驗前準備
RNA樣品,、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（以諾唯贊R312為例）
2. 實驗步驟
① 試劑化凍后,，用手輕彈混勻后短暫離心。
② 基因組DNA（gDNA）去除：根據(jù)RNA樣品的濃度按10pg~1μg計算用量,，在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O,，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA樣品,，總體系為10μL,。用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀,，設(shè)置反應(yīng)條件為42℃ 2min,。
③ 第一鏈cDNA合成：根據(jù)上一步反應(yīng)管的數(shù)量按以下體系在RNase-free離心管中配制預(yù)混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆轉(zhuǎn)錄引物（2μM）1μL,，10×RT Mix 2μL,，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混勻后短暫離心,。在上一步得到的反應(yīng)管中每管加入10μL,，用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀,，設(shè)置反應(yīng)條件為25℃ 5min,，50℃ 15min，85℃ 5min,。所得cDNA產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)或-20℃保存,。
三、注意事項：
1. 防止RNase污染：保持實驗區(qū)域潔凈,；操作時需穿戴干凈的手套,、口罩；實驗所用的離心管,、槍頭等耗材均需保證RNase-free,。
2. 反應(yīng)液的配制要在冰上操作完成，防止溫度過高造成RNA降解,。
3. cDNA保存時避免反復(fù)凍融,。
四、常見問題：
1. 逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物可以測濃度嗎？
不建議測濃度,，一般評估RNA模板的質(zhì)量,，需要從濃度、純度及完整性三方面進行考量,，但逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物是一個混合體系,，有cDNA、未全逆轉(zhuǎn)錄的RNA,、dNTP,、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分，會干擾cDNA的吸光度,，因此不建議用逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA來檢測濃度與純度,。
2. 如何檢測RNA逆轉(zhuǎn)錄成功與否？
1) 內(nèi)參法：理論上,，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA是長度不同的DNA片段,，所以電泳條帶應(yīng)該均勻分布在泳道上，如果RNA豐度低,，電泳檢測也可能無產(chǎn)物,，這種情況通過PCR擴增內(nèi)參基因，如果有擴增產(chǎn)物,，cDNA的質(zhì)量基本上可以保證(少數(shù)情況下：如目的基因片段過長,，可能會有例外)。
2) 已知基因擴增法：如果有已知以此模板擴出來的基因,，可以用此基因的引物驗證,。能擴增出內(nèi)參，不一定就說明cDNA沒有問題,，因為內(nèi)參在cDNA中豐度高,，容易擴增。如果cDNA因為各種原因?qū)е虏糠纸到?，則會大大影響低豐度的目的基因的PCR結(jié)果,，而內(nèi)參因為是高豐度基因，擴增很可能不受影響,。
3. 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在gDNA對后續(xù)qPCR實驗有何影響,？
當cDNA產(chǎn)物中混有gDNA時，cDNA和gDNA在qPCR反應(yīng)時會被同時擴增,，無法區(qū)分熒光信號是來自于cDNA還是gDNA，因此定量結(jié)果可能會存在偏差,。特別是低表達量的基因,，本身的擴增信號低，Ct值大，更加容易受到gDNA污染的影響,。在逆轉(zhuǎn)錄的時候,，加一步gDNA去除的步驟，能夠有效降低gDNA污染的影響,，增加實驗的可信度,。