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       優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌,。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比,。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留,，在最后一步產(chǎn)生信號。而不充分的洗滌會導(dǎo)致差異和高背景,，從而帶來不理想的結(jié)果,。下面將為你介紹一些利用自動洗板機來洗滌ELISA平板的技巧。

       免疫分析,，比如ELISA,，一般包含兩個或以上的孵育步驟,，中間以洗滌隔開。ELISA通常在96孔板中開展,，其上包被了結(jié)合抗原或抗體,。在封閉步驟后，包被后的平板首先與一抗或抗原孵育,。隨后通過一些洗滌步驟去除未結(jié)合（低親和力）的抗原-抗體復(fù)合物,。接著，平板與二抗孵育,。這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合,。之后，又是一輪洗滌,。最后是添加底物并檢測信號,。

我們可使用多種底物來檢測最終的抗原-抗體復(fù)合物。底物分為三類：自然發(fā)光,、化學(xué)發(fā)光和熒光,。準(zhǔn)確說來，ELISA這個詞指的是使用自然發(fā)光底物的分析,。而使用化學(xué)發(fā)光底物的分析被稱為Luminescent Immunoassay（LIA）,，使用熒光二抗的分析被稱為Fluorescent Immunoassay（FIA）。

1,、洗滌參數(shù)：

第一個主要的參數(shù)是洗滌量,。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景,，那么不要猶豫,，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高,。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到,，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同,。

ELISA板的制造商通常會在試劑盒的使用手冊中列出包被量,。行業(yè)中通常使用的包被量是200µl。如果你的試劑盒也是這樣,，那么制造商可能會建議使用300µl洗滌液進行洗滌,，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁。一般來說,，洗滌量越高,，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

2,、洗滌次數(shù)：

第二個影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量,。當(dāng)然,，洗滌次數(shù)越多，背景越低,。然而,，太多次的洗滌會降低信號強度，使其難以測定,。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次,。不過，ELISA板的制造商會對洗滌次數(shù)提出建議,。一般而言,，制造商包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板,，必須優(yōu)化洗滌次數(shù),。

控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,，96孔板的每個孔能容納330至460 µl,。不過，有些自動化洗板機可設(shè)置程序,，分配遠遠超出這個量的洗滌液,，比如1 ml。它是如何做到的呢,？其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能,。換句話說,，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出,。這種技術(shù)能增加洗滌量,，但不會溢出到其他孔中。

3,、抽吸：

另外,，還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置,，這兩者都能調(diào)整,，以降低背景（殘留量）和差異。

殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體,，它們會增加背景信號,。殘留量越小，殘留液體越少,，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少,。

吸液高度會明顯影響殘留量,；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加,。反之,，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會使吸液效率降低,，殘留量增加,。

目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動,，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜，因為你需要非常仔細地調(diào)整吸液高度,。如果你們實驗室使用幾種不同的板,，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時,，吸頭會降到反應(yīng)孔的底部,。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部,。

抽吸的位置也對殘留量有著重要影響,；如果每個孔只使用一個抽吸點（這很常見，因為更快）,，那么抽吸的位置需要優(yōu)化,。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間,，即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置,。一般來說，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處,。

反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量,。C形底（平底圓角）的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

如果沒有自動洗板機,，采用手工洗滌,，那么也需要注意幾點。使用8道或12道微量移液器,，采用倒吸的方法進行洗滌,；不同廠家的洗液不宜相互混用。洗板時需保證微孔板平放,，將洗滌液注滿各孔,，但盡量避免漏液yi液，以每孔300 µl為宜；板洗次數(shù)一般為3次,，要保證洗板的浸泡時間,，每次浸泡時間一般為30-60 秒；盡量減少洗液殘留量,，推薦每次洗板后進行拍板,，并及時更換吸水紙，避免吸水紙的碎屑粘到反應(yīng)孔內(nèi),。

ELISA看起來很簡單,，但是在實際操作過程中，也不能掉以輕心,，還是應(yīng)該仔細檢查洗滌步驟,，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。