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免疫組化實驗步驟及問題解答
閱讀：864 發(fā)布時間：2024-2-5免疫組化基本原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素,、酶、金屬離子,、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),，對其進行定位、定性及定量的研究,。
1,、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
a ,、組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b ,、無水乙醇中浸泡五分鐘
c 、95%乙醇中浸泡五分鐘
d,、 75%乙醇中浸泡五分鐘
2,、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：
A 、抗原熱修復(fù)
a ,、高壓熱修復(fù)： 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋,，但不能鎖定,。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓,，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來,。10分鐘后除去熱源,，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子,。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù),。
b、 沸熱修復(fù)：電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右,，放入組織芯片加熱10-15分鐘,。
c、 微波爐加熱：在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入,，斷電,，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次,。適用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等,。
B、 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液,。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時間約為5-30分鐘,。適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
免疫組化問題解答：
1,、染色過強
a 、抗體濃度過高或孵育時間過長 降低抗體滴度,、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜,；
b、 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度,；
c,、 DAB顯色時間過長或濃度過高 顯色時間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準,。
2,、非特異性背景染色
a、 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘,；
b,、 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長；
c,、 組織中含內(nèi)原性生物素 正常非免疫動物血清再封閉,；
d,、 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間。
3,、染色弱
a ,、抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度,、孵育時間不能少 于60分鐘,；
b、 試劑超過有效使用時間 應(yīng)更換試劑,；
c,、 操作中添加試劑時緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋 （應(yīng)防止切片干燥）；
d,、 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜,；
e、 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘,。
4,、染色陰性
a 、操作步驟錯誤 應(yīng)重試 設(shè)陽性對照,；
b,、 組織中無抗原 設(shè)陽性對照以驗證試驗結(jié)果；
c,、 一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無誤,。