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DNA提取試劑盒試驗必看事項
閱讀：975 發(fā)布時間：2023-12-18一,、RNA和DNA提?。?/strong>
裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液,。
Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用,。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍,、尿素和高氯酸鋰,。
洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解,。
溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進行裂解,。蛋白酶 K 就是其中之一,，實際上在這些變性緩沖液中效果較好；當?shù)鞍踪|(zhì)變性增多,，蛋白酶 K 的作用也會相應增強,。然而，溶菌酶在變性中不起作用,，因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進行,。
二、關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項
分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的,，因為必須質(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻,，您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì),，并且無法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開來。因此,，在質(zhì)粒制備過程中中,，直到裂解后才加入離液劑，鹽用于結(jié)合,。
三,、DNA 提取后純化：將 DNA 與色譜柱結(jié)合
離液鹽對于裂解至關(guān)重要，而且對于將 DNA（或 RNA）與色譜柱結(jié)合也是如此,。此外,，為了增強和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合,，還添加了酒精。
大多數(shù)情況下這是乙醇,，但有時可能是異丙醇,。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多,，你會帶入大量降解的核酸和小物種,，這會影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少,，可能難以從膜上洗掉所有鹽分,。
如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑，請嘗試使用NaCl 作為沉淀劑,，以避免去污劑污染 DNA 或 RNA,。
四、洗滌 DNA（或 RNA）
當裂解物通過硅膠膜進行離心分離,，現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應該與柱子結(jié)合,，雜質(zhì)、細胞蛋白和多糖應該已經(jīng)通過了,。
但是,，膜仍然被殘留的細胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來自植物,，仍然會有多糖,，也許一些色素留在膜上，或者如果樣品是血液,，膜可能會被染成棕色或黃色,。
洗滌步驟用于去除這些雜質(zhì)。
通常有兩次洗滌,，盡管這可能因樣品類型而異,。第一次洗滌通常會含有少量的離液鹽，以去除蛋白質(zhì)和有色污染物,。這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽,。
如果開始的準備工作沒有大量蛋白質(zhì)，例如質(zhì)粒準備或 PCR 清理,，則只需要乙醇洗滌,。去除離液鹽對于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至會用乙醇清洗柱子兩次,。如果殘留鹽分,，核酸的洗脫會很差，A230讀數(shù)會很高,，導致260/230的比率很低,。對于無乙醇 DNA 和 RNA,，需要進行干法離心，乙醇洗滌后,，大多數(shù)方案都有一個離心步驟來干燥柱子,。這是為了去除乙醇，對于清潔的洗脫液是必須的,。 當將 10 mM Tris 緩沖液或水應用于膜進行洗脫時,，核酸會水合并從膜中釋放出來。如果色譜柱上仍有乙醇,，則核酸無法全再水合,。如果跳過干燥步驟會導致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,，所以它不會出現(xiàn)在您的讀數(shù)中,。
五、RNA 和 DNA 提?。合疵?/strong>
DNA 提取方案的還剩余IDE步驟步就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA,。
對于 DNA 制備，通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris,。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩(wěn)定,，在緩沖液中溶解得更快。即使對于 DNA 顆粒也是如此,。水的 pH 值往往較低,，低至 4-5，并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時間內(nèi)可能無法全再水合,。
通過在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘,，可以較大限度地洗脫 DNA。
由于RNA 易溶于水,，且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環(huán)境下,。
六、RNA 和 DNA 提取實驗中的問題
1.產(chǎn)量低
如果您遇到的 DNA/RNA 產(chǎn)量低于您對樣品的預期,，則需要考慮許多因素,。通常，這是一個裂解問題,。不全裂解是產(chǎn)量低的主要原因。它也可能是由不正確的綁定條件引起的,。確保使用新鮮的優(yōu)質(zhì)乙醇（100% 200 標準）稀釋緩沖液或添加到結(jié)合的步驟,。劣質(zhì)乙醇或舊庫存可能已經(jīng)吸收了水分，并且濃度不正確,。如果洗滌緩沖液制備不正確,，您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA,。
2.低純度
如果提取的 DNA 被蛋白質(zhì)污染（低 260/280），那么您可能開始時樣品過多,，而蛋白質(zhì)沒有全去除或溶解,。
如果 DNA 的 260/230 比率不佳，則問題通常是結(jié)合或洗滌緩沖液中的鹽分,。確保使用最高質(zhì)量的乙醇來制備洗滌緩沖液,，如果問題仍然存在，請再次洗滌色譜柱,。
與其他樣品相比,，一些樣品含有更多的抑制劑。環(huán)境樣品特別容易出現(xiàn)純度問題,，因為腐殖質(zhì)在提取過程中會被溶解,。
腐殖質(zhì)的行為與 DNA 相似，很難從硅膠柱中去除,。
3.降解
降解問題是RNA制備中常常到的問題,。因為在 RNA 提取過程中，樣品儲存不當或裂解效率低等情況都會導致降解,。對于 DNA 提取,，降解不是一個大問題，因為對于 PCR,，DNA 可以被剪切并且工作正常,，如果不希望有較多剪切的 DNA，可以使用弱裂解的方法,。
七,、PCR 清理時的注意事項
PCR 凈化其實并不是 DNA 提取技術(shù)本身，但它是一種效率高且簡單的技術(shù),，它只是添加高濃度的結(jié)合鹽（通常每體積 PCR 反應 3-5 體積鹽）和離心來過濾,。
在實驗過程中，PCR Clean-up 試劑盒出現(xiàn)故障也會導致整個實驗功虧一簣,。
因為在PCR 反應中有較多吸收 260 度紫外線的物質(zhì),，比如：核苷酸、去污劑,、鹽和引物,。所以，PCR 凈化試劑盒經(jīng)常無法正常工作可能是由于 PCR 反應失敗所造一般成較難清理,。