日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

WB,，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱(chēng)免疫印跡(immunoblotting),，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法,。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù),，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、蛋白質(zhì)樣品制備

原始樣品可為細(xì)胞,、組織,、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白,，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法,，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理,。

2.棄培養(yǎng)基,，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基,。

3.加入1X SDS樣品緩沖液,，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管,。注意：冰上操作,。

4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5.煮沸樣品5min,。

6.離心12000g,，5min,，取上清。

二,、SDS-PAGE電泳

1,、清洗玻璃板

2、灌膠與上樣

1). 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊,。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠,。

2). 配 10％ 分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠,。灌膠時(shí),，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可,。然后膠上加一層水,，液封后的膠凝的更快。

3). 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),，說(shuō)明膠已凝了,。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

4). 配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠,。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中,。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出,。

5). 用水沖洗一下濃縮膠,，將其放入電泳槽中。

6). 在電泳槽的上,、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液,，上樣。

7). 連接電泳槽到電泳儀,。上槽接負(fù)極,下槽接正極,，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V,，電泳2h或當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至離底部1cm時(shí),，停止電泳。

三,、轉(zhuǎn)膜

1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡 10min,。 注意：若檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步,，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠,。

2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。 如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘,。

3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿3層濾紙膠膜,，3層濾紙海綿,，每層放好后,，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負(fù)極面(黑色面),。

4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中,，放入三明治(黑色面對(duì)黑色面)，加轉(zhuǎn)移緩沖液,， 插上電極,，100V，1h(電流約為 0.3A),。

5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,，切斷電源，取出雜交膜,。

四,、封閉與雜交

1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫,，搖動(dòng),。

2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng),。

3.15mlTBS/T洗3次(5min/T),。

4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過(guò)夜,，緩慢搖動(dòng),。

5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗,，室溫孵育1h,，緩慢搖動(dòng)。

7.15ml TBS/T洗3次(5min/T),。

8.15ml TBS洗1次,。

五、顯色

將 A,、B 發(fā)光液按比例稀釋混合,。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干,，反貼法覆于 A,、B 混合液滴上，熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干,，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中,，迅速蓋上膠片,，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光,。取出膠片立即浸入顯影液中 1～2min,，清水漂洗一下后放在定影液中至底片全定影，清水沖凈晾干,，標(biāo)定Marker,，進(jìn)行分析與掃描。