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      實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR）,，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，最后通過(guò)特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。下面對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常解析：

1,、無(wú)Ct值出現(xiàn)

a),、 檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時(shí)采集，探針?lè)▌t一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào),。
b) ,、引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。
c) ,、模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起,。
d) 、模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,。
e) ,、反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個(gè)循環(huán)以上,，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào),。

2,、Ct值出現(xiàn)過(guò)晚

a) 、擴(kuò)增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件,，嘗試三步法擴(kuò)增程序,，或者重新設(shè)計(jì)引物。
b),、 模板濃度太低：減少稀釋度,，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
c),、 模板降解：重新制備模板,，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
d),、 PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般將PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為100 bp-200 bp之間,。
e) 、反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時(shí)帶入,，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高,，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3,、陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增

a) 反應(yīng)體系組分（如水）被污染：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,，更換新的Mix或者水重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
b) 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制,，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分,，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭,。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),。
d) 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比,。在35循環(huán)后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況,，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。

4,、熔解曲線出現(xiàn)多峰

a),、 非特異性擴(kuò)增。
b) ,、引物設(shè)計(jì)不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),。
c)、 引物濃度不佳：適當(dāng)調(diào)整引物濃度。
d) ,、退火溫度低：提高退火溫度,。
e)、 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理）,，或通過(guò)設(shè)計(jì)引物避免非特異性擴(kuò)增,。

5、出現(xiàn)引物二聚體

a) ,、優(yōu)化擴(kuò)增條件,，如提高退火溫度，可利用梯度PCR,，摸索最佳的Tm值,。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進(jìn)入60℃退火和延伸步驟)有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為60°C,。
b),、 引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度,。
c) ,、可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶,，通常位于100 bp以下,。

6、擴(kuò)增效率低

a),、 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解,。
b)、 反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法,。
c),、 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋,，再加入到體系中,，減少抑制物的影響,。

7,、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差

a)、 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍,，擴(kuò)大反應(yīng)體積,，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中,。
b),、 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器。
c)、 模板濃度太低：模板濃度越稀,，重復(fù)性越差,，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d),、 qPCR mix沒(méi)有混勻,，請(qǐng)使用前充分混勻。