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      實(shí)時定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。下面對實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)異常解析：

1,、無Ct值出現(xiàn)

a)、 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集,，探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號,。
b) 、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性,。
c) ,、模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) ,、模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,。
e) 、反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán),，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號,。

2、Ct值出現(xiàn)過晚

a) ,、擴(kuò)增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件,，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)引物,。
b),、 模板濃度太低：減少稀釋度，重復(fù)實(shí)驗(yàn),。
c),、 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn),。
d),、 PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計(jì)為100 bp-200 bp之間。
e) ,、反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時帶入,，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn),。

3,、陰性對照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增

a) 反應(yīng)體系組分（如水）被污染：實(shí)驗(yàn)過程中，更換新的Mix或者水重復(fù)實(shí)驗(yàn),。
b) 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制,，對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分，減少氣溶膠污染,；使用帶濾芯的槍頭,。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度,，并注意上下游引物的濃度配比,。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析,。

4,、熔解曲線出現(xiàn)多峰

a)、 非特異性擴(kuò)增,。
b) ,、引物設(shè)計(jì)不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c),、 引物濃度不佳：適當(dāng)調(diào)整引物濃度,。
d) 、退火溫度低：提高退火溫度。
e),、 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理）,，或通過設(shè)計(jì)引物避免非特異性擴(kuò)增。

5,、出現(xiàn)引物二聚體

a) ,、優(yōu)化擴(kuò)增條件，如提高退火溫度,，可利用梯度PCR,，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進(jìn)入60℃退火和延伸步驟)有利于強(qiáng)效擴(kuò)增,，因此引物設(shè)計(jì)時設(shè)定的成功退火溫度為60°C,。
b)、 引物濃度太高,，適當(dāng)降低引物濃度,。
c) 、可通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體,。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶,，通常位于100 bp以下。

6,、擴(kuò)增效率低

a),、 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b),、 反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
c),、 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入,，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋，再加入到體系中,，減少抑制物的影響,。

7、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差

a),、 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍,，擴(kuò)大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋,，以大體積加入反應(yīng)體系中,。
b)、 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器,。
c),、 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積,。
d),、 qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻,。