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RNA純化過程中需注意的問題
閱讀：860 發(fā)布時間：2023-9-11RNAse的無處不在導致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的質(zhì)量，在RNA純化過程中要特別注意的10個問題介紹,。
1、在收獲組織及細胞死亡之后,，應立即滅活內(nèi)源的RNA酶,，以防止RNA降解。以下3個方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：
1）用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品,，并立即勻漿,。
2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小,，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié),，以確保瞬間令RNA酶失活
3）立即將樣品置于RNAlater? Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中,。它是一種水相,、無毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護完整,、未凍結(jié)的組織和細胞樣品中的RNA,。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠薄（<0.5 cm）,，這樣RNAlater才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中,。
2、使用正確的細胞或組織儲存條件
在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后,，應該儲存在-80°C,，千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍,，也會導致RNA的降解和損失,。瞬間凍結(jié)的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進行勻漿,。
RNAlater使樣品儲存更為便利,。儲存在RNAlater中的細胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達1個星期，在4°C可穩(wěn)定保存長達1個月,，或永jiu 保存在-20°C,。有關RNAlater的更多信息請參考 .
3、徹di 勻漿樣品
細胞或組織的徹di 勻漿對RNA提取來說,，是一個很關鍵的步驟,，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據(jù)細胞或組織的類型來選擇,。大部分培養(yǎng)的細胞可以置于細胞裂解液中,，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿；而動物組織、植物組織,、酵母和細菌則常常需要更加劇烈的方法,。比如說細菌的細胞壁，就需要酶消化來實現(xiàn)徹di的細胞裂解和RNA的最大回收,。有關各種不同的樣本類型,，哪些方法是最適he的勻漿方法，請參考 .
4,、在RNA提取之前預處理樣品裂解液
對于某些樣品來說,，在勻漿之后，RNA提取之前,，還需要一些額外的處理步驟,。對于脂肪含量高的組織，像腦組織和脂肪組織得到的裂解液,，就需要通過氯仿抽提來去除脂類,，從而提高RNA產(chǎn)量。許多植物組織中富含多酚和多糖,，會降低RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量,，用Plant RNA Isolation Aid 預處理裂解液可去除這些難以處理的成分。
5,、選擇最好de RNA分離方法
現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍,。目前zui 簡單也是zui 安全的方法是柱式分離，如RNAqueous? 或RNAqueous-4PCR Kit,。因為操作簡單,，所以這些步驟特別適用于同時處理多個樣品。如果是處理復雜的組織,，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（腦和脂肪組織）的樣品,，就推薦使用更加嚴格的、基于酚處理的RNA分離方法,，如ToTALLY RNA?,。更多的信息請參考 。更多方法選擇,，請參考
6,、DNase處理
如果提取的RNA將用于RT-PCR，我們推薦用DNase處理純化的RNA樣品以去除殘留的DNA污染,。當樣品來源于富含DNA的組織,，如脾臟時，DNase處理也是一個好辦法 ,。RNAqueous-4PCR Kit的實驗流程中包含了DNase處理的步驟,，并提供了必需的試劑（DNA酶I）,。DNA-free? DNase treatment & Removal Reagents 則可用于去除用各種方法制備的RNA樣品中的DNA污染。這兩個產(chǎn)品都提供了高質(zhì)量的DNase I,，優(yōu)化的反應緩沖液,，和DNA酶消化處理后簡單快速去除DNase的方法，無需使用有機溶劑和熱處理,。
7,、減少環(huán)境RNase的暴露
為了得到完整的、高品質(zhì)RNA,，在整個RNA制備過程中，當RNA離開強蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護時,，避免引入新的RNase污染就非常關鍵,。由于RNase幾乎是無所bu在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣東西都是無RNase污染的,。所有的表面,，包括移液器、工作臺,、玻璃器皿和制膠設備,，都必須用表面去污凈化溶液如RNaseZap? 或RNaseZap Wipes 來處理過。必須保證一直使用無RNase的槍頭,、試管和溶液,，手套也應經(jīng)常更換。
8,、正確的沉淀
純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮,，以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5 M 醋酸銨,、2-2.5體積的無水乙醇,，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml）,，可以采用共沉淀（如糖原glycogen,,、酵母yeast RNA或linear acrylamide）的方法。當RNA用于RT-PCR分析時,，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑,，因為它們都不含DNA污染。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染,，有可能影響RT-PCR的結(jié)果,。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥,，因為這可能導致很難重新溶解,。
9、重懸
許多RNA提取步驟的最后一步是溶解純化的RNA沉淀。理想的重懸溶液應該滿足3點要求：無RNase污染,、較低的pH值（pH 6-7）,、含有螯合劑，以保護RNA不受帶入的RNase的降解,。（THE RNA Storage Solution能滿足以上所有標準,。）為了幫助溶解，RNA沉淀可置于重懸溶液中在65°C孵育5分鐘,，并不時輕搖以幫助溶解,。
10、儲存
如果只是短期儲存,，重懸的RNA應放置于-20°C,；如果是長期儲存的話，就應該放置于-80°C,。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲存在-80°C,，但保存于醋酸銨/乙醇溶液中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中,。這會避免反復凍融損傷RNA,，并預防偶然的RNase污染。