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蛋白質(zhì)純化膠體過濾法步驟
閱讀：829 發(fā)布時間：2023-8-28 不同大小的蛋白質(zhì)分子進入膠體過濾管柱,，可依其分子量差異分離,；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊,，GelFiltration）,。
儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）,、鐵架、鐵夾及水平儀,；部分收集器（fractioncollector,需準(zhǔn)備干凈試管約100支）,；濃縮用離心機（低速5,000rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法
藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA-150平衡好,，并且使wan全沈降后的膠體體積,，占全部體積的七至八成；要先預(yù)估好膠體的使用量,。b.膠體溫度要與操作場所的溫度一致,，否則溫度變化會產(chǎn)生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力,，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附,。BufferA-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合（Bio-Rad151-1901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD）,，chickenovalbumin（44kD）,，equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1,350）
方法步驟：
1,、管柱裝填：
1）,、以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）,；并請了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法,，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器,，并以bufferA-150試看管路是否通暢,；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行,。注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng),，不要裝置于交通要沖。
2）,、依預(yù)估量取出Sephacryl膠體,，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩,，使的wan全懸浮,，但勿產(chǎn)生太多氣泡。
3）、在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液,，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱,，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快,。當(dāng)膠體上方的液面逐漸降低時,，可于頂端添加膠體，以達所要高度,；膠體高度約90cm.
4）,、膠體wan全沈降后，小心以bufferA-150加滿管柱,，關(guān)閉出口,，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗,。調(diào)整緩沖液瓶高度,，使流速約每五~六秒一滴，并設(shè)定收集體積為2.5mL/tube.
5）,、膠柱流洗約100mL后,，關(guān)閉出口，拆開頂端端蓋,，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高,，注意勿破壞膠體表面平整；然后打開出口,，使液面下降至膠體面,，再關(guān)閉出口，準(zhǔn)備注入樣本,。
二,、 樣本色析進行：
6）、以微量移液器或滴管吸取樣本（樣本體積不得超過膠體總體積的3%）,，沿著膠體上方管壁緩慢加入,，注意切勿破壞膠體的平整表面！（樣本確實體積_______mL）
7）,、打開出口,，同時開啟部分收集器；當(dāng)樣本wan全沒入膠體時,，關(guān)閉出口,，緩緩加入與樣本相等體積的bufferA-150,打開出口待其慢慢進入膠體中,，如此重復(fù)二次,。不得擾動膠體表面，造成凹陷。
8）,、暫時關(guān)閉出口,，將液面高度加滿至管柱頂端，并把頂端端蓋鎖上,；然后打開出口開始溶離,，調(diào)整緩沖液瓶的高度，使流速為6s一滴,。
9）,、要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統(tǒng)運轉(zhuǎn)無礙,，小心部分收集器最容易出問題,。管柱預(yù)計將流洗過夜，收集約80管,。
10）,、收集試管，進行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS活性測定,，并請作圖,。
11）、收集GUS活性區(qū),，以Centriprep-30濃縮至10mL后,，加bufferA-0稀釋至20mL,再次濃縮至_______mL（GF），保留100μL.
12）,、管柱請再以bufferA-150流洗100mL后,，小心放置一旁，準(zhǔn)備以后進行分子量測定,。
三,、分子量測定：
13）、進行分子量測定前一天,，請先以bufferA-150流洗100mL,，并檢查膠柱內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生，若有嚴重的氣泡或干裂,，必須重新裝填管柱,。
14）、取標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液0.4mL,加上純質(zhì)目標(biāo)酶0.5mL（以親和層析法所得的AF部份）,，如上法注入管柱中,，立刻開始進行膠體過濾，并收集各分劃,。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點,。
15）,、收集所得，進行蛋白質(zhì)定量分析,，可定出數(shù)個蛋白質(zhì)尖峰,，以作為分子量依據(jù)；另以目測法,，決定紅色高峰的管數(shù),，則可定出vitaminB12的溶離管數(shù)。利用以上數(shù)據(jù),，可畫出分子量與溶離管數(shù)間的直線關(guān)系,，作為分子量判定的標(biāo)準(zhǔn)校正線。
16）,、同樣的一批分劃,，請進行酶活性分析（GUS），則可定出酶的溶離體積,，對照上述標(biāo)準(zhǔn)校正線,，則可求出酶的分子量。
四,、 拆除管柱及保存膠體：
17）,、若管柱長期不用，應(yīng)當(dāng)自管柱中取出膠體,，以緩沖液清洗后,，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中,。膠體若裝填太緊,，有時可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來,。
18）,、膠體可以加0.01%NaN3防止霉菌生長，但使用前記得要洗去,；再度使用時,，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結(jié)塊而不易打散者,，也不要使用,。