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蛋白質(zhì)純化膠體過濾法步驟
閱讀：1141 發(fā)布時間：2023-8-28 不同大小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)入膠體過濾管柱,，可依其分子量差異分離；是一種廣泛應(yīng)用的partition色析法（Pharmacia操作手冊,，GelFiltration）,。
儀器設(shè)備：色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、鐵架,、鐵夾及水平儀,；部分收集器（fractioncollector,需準(zhǔn)備干凈試管約100支）；濃縮用離心機(jī)（低速5,000rpm）,；濃縮用離心管Centriprep-30（Amicon4322）請注意其使用方法
藥品試劑：膠體SephacrylS-300（Pharmacia）：a.預(yù)先以緩沖液bufferA-150平衡好,，并且使wan全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成,；要先預(yù)估好膠體的使用量,。b.膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產(chǎn)生氣泡,。c.Sephacryl系列膠體有相當(dāng)大的吸附力,，因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。BufferA-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標(biāo)準(zhǔn)分子量組合（Bio-Rad151-1901）：溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD）,，bovinegammaglobulin（158kD）,，chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD）,，vitaminB12（1,350）
方法步驟：
1,、管柱裝填：
1）、以純水沖洗玻璃管柱（以純水上下沖洗即可,，嚴(yán)禁使用試管刷）,；并請了解管柱的構(gòu)造與拆裝方法，垂直架好管柱,，以軟管連接部分收集器,，并以bufferA-150試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管,，則可控制溶離的進(jìn)行。注意系統(tǒng)的擺設(shè)要適當(dāng),，不要裝置于交通要沖,。
2）、依預(yù)估量取出Sephacryl膠體,，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡,；將瓶中的膠體上下震蕩，使的wan全懸浮,，但勿產(chǎn)生太多氣泡,。
3）,、在管柱內(nèi)加入約10cm高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱,，一直加到管柱頂端,，開始流洗后膠體沈降很快。當(dāng)膠體上方的液面逐漸降低時,，可于頂端添加膠體,，以達(dá)所要高度；膠體高度約90cm.
4）,、膠體wan全沈降后,，小心以bufferA-150加滿管柱，關(guān)閉出口,，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶,，打開出口以重力流洗。調(diào)整緩沖液瓶高度,，使流速約每五~六秒一滴,，并設(shè)定收集體積為2.5mL/tube.
5）、膠柱流洗約100mL后,，關(guān)閉出口,，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高,，注意勿破壞膠體表面平整,；然后打開出口，使液面下降至膠體面,，再關(guān)閉出口,，準(zhǔn)備注入樣本。
二,、 樣本色析進(jìn)行：
6）,、以微量移液器或滴管吸取樣本（樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入,，注意切勿破壞膠體的平整表面?。颖敬_實體積_______mL）
7）、打開出口,，同時開啟部分收集器,；當(dāng)樣本wan全沒入膠體時，關(guān)閉出口,，緩緩加入與樣本相等體積的bufferA-150,打開出口待其慢慢進(jìn)入膠體中,，如此重復(fù)二次。不得擾動膠體表面,，造成凹陷,。
8）,、暫時關(guān)閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端,，并把頂端端蓋鎖上,；然后打開出口開始溶離，調(diào)整緩沖液瓶的高度,，使流速為6s一滴,。
9）、要留心觀察前面幾個分劃,，確定整個系統(tǒng)運轉(zhuǎn)無礙,，小心部分收集器最容易出問題。管柱預(yù)計將流洗過夜,，收集約80管,。
10）、收集試管,，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析以及GUS活性測定,，并請作圖。
11）,、收集GUS活性區(qū),，以Centriprep-30濃縮至10mL后，加bufferA-0稀釋至20mL,再次濃縮至_______mL（GF）,，保留100μL.
12）,、管柱請再以bufferA-150流洗100mL后，小心放置一旁,，準(zhǔn)備以后進(jìn)行分子量測定,。
三、分子量測定：
13）,、進(jìn)行分子量測定前一天,，請先以bufferA-150流洗100mL，并檢查膠柱內(nèi)有無氣泡產(chǎn)生,，若有嚴(yán)重的氣泡或干裂,，必須重新裝填管柱。
14）,、取標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液0.4mL,加上純質(zhì)目標(biāo)酶0.5mL（以親和層析法所得的AF部份）,，如上法注入管柱中，立刻開始進(jìn)行膠體過濾,，并收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點,。
15）,、收集所得,，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，可定出數(shù)個蛋白質(zhì)尖峰,，以作為分子量依據(jù),；另以目測法，決定紅色高峰的管數(shù),，則可定出vitaminB12的溶離管數(shù),。利用以上數(shù)據(jù)，可畫出分子量與溶離管數(shù)間的直線關(guān)系,，作為分子量判定的標(biāo)準(zhǔn)校正線,。
16）、同樣的一批分劃,，請進(jìn)行酶活性分析（GUS）,，則可定出酶的溶離體積，對照上述標(biāo)準(zhǔn)校正線,，則可求出酶的分子量,。
四、 拆除管柱及保存膠體：
17）,、若管柱長期不用,，應(yīng)當(dāng)自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗后,，置冷藏室中保存,，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊,，有時可能不易取出,，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。
18）,、膠體可以加0.01%NaN3防止霉菌生長,，但使用前記得要洗去；再度使用時,，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒,，若有結(jié)塊而不易打散者，也不要使用,。