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    原代細(xì)胞分離的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法,，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞。

1,、胰蛋白酶 純化法

1）,、在去除不需要的組織后,，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,，去除上清液,。重復(fù)清洗2到3次。

2）,、將盛有組織碎片的容器置于冰上,，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。

3）,、在4℃孵育6到18小時,，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

4）,、移棄組織碎片中的胰蛋白酶,，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

5）,、在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基,，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基,，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑,。

6）、通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過濾,，分散所有剩余組織,。計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng),。

2,、膠原酶純化法

1）、用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次,。

2）、加入膠原酶（50～200單位/ml,，溶解在HBSS中）,。

3）、在37℃孵育4到18小時,。加入3mM CaCl2增加解離效率,。

4）、通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,，以分離分散細(xì)胞,、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,，在碎片中加入新鮮的膠原酶,。

5）、通過離心在HBSS中清洗懸液幾次,。

6）,、再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計數(shù)和接種細(xì)胞,，進(jìn)行培養(yǎng),。

3、Dispase純化法

1）用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次,。

2）,、加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）

3）、在37℃孵育20分鐘到幾個小時,。

4）,、通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞,、組織碎片和較大的碎片,。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase,。

5）,、通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

6）,、再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,，計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng),。

分離細(xì)胞后,，首ci 傳代需要注意的問題：

1）、傳代培養(yǎng)時先觀察細(xì)胞的活性,。

2）,、細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%，密度控制在80%左右

3）,、對于無血清培養(yǎng)基,，需要降低胰蛋白酶使用量。

（1）,、 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基,。

（2）、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細(xì)胞,。在培養(yǎng)瓶背著細(xì)胞的一面加入清洗溶液,，通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液,。

（3）,、加入胰酶消化，消化細(xì)胞與細(xì)胞,，操作手法,，試劑的效價有密切的關(guān)系，消化時應(yīng)注意觀察細(xì)胞形態(tài),，如細(xì)胞變得橢圓透亮，并且可以觀察到細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙時，輕拍瓶身可以看見成流沙狀,，即可中止消化,，消化時盡量減少對細(xì)胞的吹打。

（4）,、當(dāng)細(xì)胞*分離時,，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部,。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基中止消化,，計數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

（5）,、對于無血清培養(yǎng)基,，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性,。