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ELISA試劑盒中各HRP底物操作說明
閱讀：1080 發(fā)布時間：2023-6-5 ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣,，HRP即辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase）比活性高，穩(wěn)定,，分子量小，純酶容易制備,，所以zui 常用,。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分，對試劑盒的質量有重要影響,。HRP底物主要包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB),、氯萘酚和氨乙基咔唑等,。
一、二氨基聯(lián)苯胺／金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶最敏感,、常用的底物,。它產生強烈的棕色產物，在水和醇中不溶解,。多數(shù)情況下,，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷,、鎳至底物液中,，辣根過氧化物酶可以更加敏感,。此類反應產物呈暗藍灰色至黑色，且在水及醇中穩(wěn)定,。DAB／金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣,。
1. 需要的溶液和特殊設備
DAB，0.05 mol／LTris緩沖液(pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化鎳/水貯存液, 30％過氧化氫, DPX, 光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果).
2. 操作步驟
(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB；
(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代),；
(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫,。過氧化氫一般以30％的溶液提供，貯存在4 ℃,，此條件可以持續(xù)1個月,；
(4) 如果出現(xiàn)沉淀,，用濾紙過濾；
(5) 加此溶液至標本,，并孵育1~20 min水洗終止反應,；
(6) 優(yōu)化：如果需要可復染；
(7) 用DPX封片,。
二、氯萘酚
氯萘酚可以形成一種藍黑色產物,。敏感性低于DAB,，且產物可溶于醇中。它適用于當DAB反應形成較高背景或要求改變產物的顏色,。
1. 需要的溶液和特殊設備
0.03％氯萘酚，用無水乙醇溶解(貯存在-20℃),，0.05 mol／LTris(pH7.6),，過氧化氫，Gelvatol或者Mowiol,，光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果),。
2. 操作步驟
(1) 氯萘酚貯存液的準備：用10 mL無水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，貯存于-20℃,；
(2) 加100 μL 氯萘酚貯存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6),；
(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫于水中,。過氧化氫一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1個月,；
(4) 白色沉淀可用濾紙過濾去除,；
(5) 加此溶液到標本中，并在室溫孵育10～40 min,，水洗終止反應,；
(6) 優(yōu)化：如果需要,，進行復染，但只可使用水溶性染料,；
(7) 用Gelvatol或者Mowiol封片,。
三、氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)產生紅色產物,，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反應產生較高背景或要求改變產物顏色的實驗,。此產物可溶于醇,，但不溶于水。
1. 需要的溶液和特殊設備
0.4％ AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解,， 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，過氧化氫,， Gelvatol或Mowiol,，光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。
2. 操作步驟
(1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC,。AEC在DMF中穩(wěn)定,，因此,，可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作為貯存液備用；
(2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,，并攪拌,；
(3) 加0.15 mL 3％過氧化氫于水中,。過氧化氫一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1個月,；
(4) 用濾紙過濾；
(5) 加此溶液到標本中,，并于室溫孵育10～40 min,，水洗終止反應；
(6) 優(yōu)化：如果需要復染,，只可用水溶性染料,；
(7) 用Gelvatol或Mowiol封片。