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實驗干貨，PCR反應(yīng)常見問題分述
閱讀：877 發(fā)布時間：2023-5-15聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加,。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR反應(yīng)常見問題分述如下：
1．假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量,， ④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：
①模板中含有雜蛋白質(zhì),，
②模板中含有Taq酶抑制劑,，
③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白,，
④在提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚。
⑤模板核酸變性不徹di,。在酶和引物質(zhì)量好時,，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改,。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想,、容易彌散的常見原因,。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度高，一條濃度低,，造成低效率的不對稱擴(kuò)增,，對策為：
①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,，如一條引物有條帶,，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗,，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高，一條亮度低,，在稀釋引物時要平衡其濃度,。
③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。
④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等,。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μl、30μl,、50μl或100μl,，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20μl后,，再做大體積時，一定要重新摸索條件,，否則容易失敗,。
物理原因：溫度對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要。如果變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低,，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率,；退火溫度過高,，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,，檢測一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會成功的,。
2．假陽性
引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計引物,。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：
①操作時應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。
②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。
③必要時,，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。
3．出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不wan全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次,，是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對策有：
①必要時，重新設(shè)計引物,。
②減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶,。
③降低引物量，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸,，也叫兩步法),。
4．出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質(zhì)量差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：
①減少酶的量，或調(diào)換另一來源的酶,。
②減少dNTP的濃度,。
③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。
④增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)