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    溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn),。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性,，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃,，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法,， 除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性,，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。
1、變性溫度與時(shí)間：

變性溫度低,，解鏈不wan全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因,。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間,，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響,。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物wan全變性,，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。

2,、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合,。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,，取決于引物的長(zhǎng)度,、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20 個(gè)核苷酸,，G+C含量約50%的引物,，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi),， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec,，足以使引物與模板之間wan全結(jié)合,。

3、延伸溫度與時(shí)間：

Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子
70℃ 60 核苷酸/S/酶分子
55℃ 24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃時(shí),， DNA 合成幾乎不能進(jìn)行,。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃,，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合,。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴(kuò)增10Kb 需延伸至15min,。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增,，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些,。