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  ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,。ELISA屬固相免疫測定，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。

  這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達(dá)到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時,，實驗表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)ding 峰,。

  為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃更為徹di，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中放置一晚,，以形成最多的沉淀,。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒實驗中一般不予采用,。

若用保溫箱,，ELISA試劑盒的ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布,，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此,。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。