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  ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,，即加標本和加酶結合物后,。ELISA屬固相免疫測定，抗原,、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。

  這是一個逐步平衡的過程,，因此需經擴散才能達到反應的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應總是需要一定時間的溫育。

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,，實驗表明,，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達ding 峰,。

  為加速反應,，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度,。抗原抗體反應4℃更為徹di,，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中放置一晚,，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長,，在ELISA試劑盒實驗中一般不予采用,。

若用保溫箱，ELISA試劑盒的ELISA板應放在濕盒內,，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育,，反應板均不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡。