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ELISA間接法和夾心法定性測定計算方法
閱讀:1011 發(fā)布時間:2023-1-5這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷,。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性,顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA中,,正常人血清反應(yīng)后??沙霈F(xiàn)呈色的本底,此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異,,因此實驗中必須加測陰性對照,。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時,,更宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo),。目視法簡捷明了,但頗具主觀性,。在條件許可下,,應(yīng)該用比色計測定吸光值,這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù),。先讀出標(biāo)本(sample,,S)、陽性對照(P),、和陰性對照(N)的吸光值,,然后進(jìn)行計算。計算方法有多種,,大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類,。
1. 陽性判定值
陽性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù),以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn),。
用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定,,試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,,須配用精密的儀器,,并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的?,F(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml,。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照,。測得A值后,先計算陰性對照A值的平均數(shù)(NC X )和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX),,兩個平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個特定的數(shù)值(例0.400),,試驗才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,,并≤1.5×NCX,,如其中之一超出此范圍,,則棄去,而已另兩個陰性對照重新計算NCX,;如有兩個陰性對照A值超出以上范圍,,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算:
陽性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本 A值>陽性判定值的為陽性,,小于陽性判定值的為陰性,。應(yīng)注意的是,式中0.05為該試劑盒的常數(shù),,只適合于該特定條件下,,而不是對各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出,,在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用,,試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。
2. 標(biāo)本/陰性對照比值
在實驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下,,這種判斷法較為合適,。在得出標(biāo)本( S)和陰性對照(N)的A值后,計算S/N值,。也有寫作P/N的,,這里的P不代表陽性(positive),而是病人(patient)的縮寫,,不應(yīng)誤解,。為避免混淆,更宜用S/N表示,。在早期的間接法ELISA中,,有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)多為各種測定所沿用,。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值,。更應(yīng)注意的是,N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,,以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,,這類試劑盒規(guī),,如N<0.05(或其他數(shù)值),則按0.05計算,,否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。