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ELISA間接法和夾心法定性測(cè)定計(jì)算方法

閱讀:1298          發(fā)布時(shí)間:2023-1-5

這類(lèi)反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷,。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性,顯色清晰者為陽(yáng)性,。但在 ELSIA中,,正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底,,此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異,,因此實(shí)驗(yàn)中必須加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類(lèi)似物,。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí),,更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的指標(biāo)。目視法簡(jiǎn)捷明了,,但頗具主觀性,。在條件許可下,應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值,,這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù),。先讀出標(biāo)本(sampleS),、陽(yáng)性對(duì)照(P),、和陰性對(duì)照(N)的吸光值,然后進(jìn)行計(jì)算,。計(jì)算方法有多種,,大致可分為陽(yáng)性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類(lèi)。

 

1. 陽(yáng)性判定值

  陽(yáng)性判定值(cut-off value)一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù),,以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn),。

  用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定,試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,,陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,,須配用精密的儀器,并嚴(yán)格按規(guī)定操作,。陽(yáng)性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過(guò)對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的?,F(xiàn)舉某種檢測(cè) HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,,陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml,。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后,,先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)(NC X )和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)(PCX),,兩個(gè)平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個(gè)特定的數(shù)值(例0.400),試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,,并≤1.5×NCX,,如其中之一超出此范圍,則棄去,,而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX,;如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍,則該次實(shí)驗(yàn)無(wú)效,。陽(yáng)性判定值按下式計(jì)算:

陽(yáng)性判定值=NCX+0.05 

標(biāo)本 A值>陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性,,小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是,,式中0.05為該試劑盒的常數(shù),,只適合于該特定條件下,而不是對(duì)各種試劑均可通用,。 

根據(jù)以上敘述可以看出,,在這種方法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用,試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生"試驗(yàn)無(wú)效"的后果,。

 

2. 標(biāo)本/陰性對(duì)照比值

  在實(shí)驗(yàn)條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下,,這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本( S)和陰性對(duì)照(N)的A值后,,計(jì)算S/N值,。也有寫(xiě)作P/N的,這里的P不代表陽(yáng)性(positive),,而是病人(patient)的縮寫(xiě),,不應(yīng)誤解。為避免混淆,,更宜用S/N表示,。在早期的間接法ELISA中,有些作者定出S/N為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),,現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用,。實(shí)際上每一測(cè)定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是,,N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多,。因此,這類(lèi)試劑盒規(guī),,如N<0.05(或其他數(shù)值),,則按0.05計(jì)算,否則將出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。


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