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盤點ELISA測定操作技術要求
閱讀：1068 發(fā)布時間：2022-11-25ELISA即酶聯(lián)吸附試驗,，是一種常用的固相酶免疫測定方法,。ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多,，而且其操作中有一定的技術要求,，下面盤點ELISA測定操作技術要求如下：
1、嚴格按照試劑說明書進行操作,。
2,、檢測前應將試劑放置室溫平衡半小時,，洗滌液應現(xiàn)用現(xiàn)配，同時觀察濃縮洗滌液中有無結晶,，若有結晶應放37℃水浴中融化后方可使用,。加入底物TMB時應注意有無顏色變化，若已顯色則可能過期或變質,，也不可使用,。
3、加樣后及時放入孵育箱,。標本較多時,，要分批操作。按照說明書步驟嚴格控制操作時間,，防止孵育時間人為延長,，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*,。
4,、封板溫育時，各孔一定要封嚴,，防止陽性標本的液體蒸發(fā),，不會引起孔間的污染，產生周邊現(xiàn)象從而導致“花板“的出現(xiàn),。
5,、應保證酶標版清潔，整個操作過程中保證酶標版不接觸次氯酸,。
6,、加酶試劑后用吸水紙在酶標版表面輕拭吸干。
7,、合理安排檢測量,，以免反應板過多造成洗板等待時間長。
8,、手動洗板時,，加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶,。洗液應新鮮配制,，以免被其他試劑污染，或染菌,。加好洗液后浸泡 30s-1min,。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的吸水紙,。需要用力拍板,，使孔內沒有可見液體掛壁,；但也不能太重,，不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續(xù)的加液,。
9,、用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔,，洗板針暢通,，洗完版后在吸水紙（選擇干凈，無塵的吸水材料）上輕輕拍干,。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結晶,，將堵塞洗板機針孔，造成全堵或半堵狀態(tài),，以致使未結合的酶標記物不能*洗脫,，而使最后底物顯色時加深，造成假陽性或花板,。廢液瓶裝滿后應及時清空,，以防止廢液回流對管道的污染，而使洗滌不*,，造成花板,。洗板結束后應用蒸餾水*清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留,。洗滌次數(shù)及加液量不可*按照試劑說明書設定,，應根據本實驗室的實際情況來設定，開展新項目前,，應做好驗證工作,，根據洗滌的效果來決定洗滌的次數(shù)和加液量。同時應根據儀器維護保養(yǎng)程序,，定期對洗板機進行維護保養(yǎng),。
10、加樣量的準確與否,，直接影響抗原抗體結合物的濃度,，直至最后顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深,，若插入太深,，吸嘴外壁可能粘連太多血清，輕微的抖動動即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中，造成交叉污染,。加樣時應盡可能的垂直加樣,，并加在包被孔的底部，不可加在孔的上部,。標本量大時,，可考慮使用排槍加試劑，可提高速度,，但使用排槍時應注意吸嘴一定要裝好,，不可松動，否則會影響加樣量的準確度,。加樣時保持顯色劑不外流,，顯色劑應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產生氣泡,。
11,、加樣時間間隔對結果也有一定的影響，在競爭抑制法試驗中,，理論上應該是標本與酶標抗體混合后同時加入反應孔,，若標本先于酶標抗體加入反應孔，則標本會先與包被抗體進行反應,，造成特異性假陽性,。若是有干擾物質存在時表現(xiàn)明顯，在公平條件下,，干擾物質與包被抗體的結合能力會低于標本,，而在非公平條件下，干擾物質會優(yōu)先與包被抗體進行結合,，出現(xiàn)假陽性,。做HBcAb項目時，若標本與酶加樣時間間隔太長,，會引起吸光度的趨勢性變化,，會造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標本,，出現(xiàn)假陽性,。
12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,，各種試劑盒的洗液不要混用,。洗液需要稀釋時，應按要求稀釋,。配制洗液應用新鮮的和高質量的超純水或雙蒸水,，電導率小于1.5μS/cm,洗液如果結晶應待其溶解后配制。配制后要測定其pH值，使其范圍在7.2-7.4之間,。