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盤點ELISA測定操作技術(shù)要求
閱讀：988 發(fā)布時間：2022-11-25ELISA即酶聯(lián)吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法,。ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定,。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求,，下面盤點ELISA測定操作技術(shù)要求如下：
1,、嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。
2,、檢測前應(yīng)將試劑放置室溫平衡半小時,，洗滌液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，同時觀察濃縮洗滌液中有無結(jié)晶,，若有結(jié)晶應(yīng)放37℃水浴中融化后方可使用,。加入底物TMB時應(yīng)注意有無顏色變化，若已顯色則可能過期或變質(zhì),，也不可使用,。
3,、加樣后及時放入孵育箱。標(biāo)本較多時,，要分批操作,。按照說明書步驟嚴(yán)格控制操作時間，防止孵育時間人為延長,，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,，難以清洗*。
4,、封板溫育時，各孔一定要封嚴(yán),，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā),，不會引起孔間的污染，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板“的出現(xiàn),。
5,、應(yīng)保證酶標(biāo)版清潔，整個操作過程中保證酶標(biāo)版不接觸次氯酸,。
6,、加酶試劑后用吸水紙在酶標(biāo)版表面輕拭吸干。
7,、合理安排檢測量,，以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。
8,、手動洗板時,，加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶,。洗液應(yīng)新鮮配制,，以免被其他試劑污染，或染菌,。加好洗液后浸泡 30s-1min,。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板,，選用無粉塵和碎屑的吸水紙,。需要用力拍板，使孔內(nèi)沒有可見液體掛壁,；但也不能太重,，不能讓樣品干太久。酶標(biāo)板拍干后立即做后續(xù)的加液,。
9,、用洗板機(jī)洗板時,，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通,，洗完版后在吸水紙（選擇干凈,，無塵的吸水材料）上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結(jié)晶,，將堵塞洗板機(jī)針孔,，造成全堵或半堵狀態(tài)，以致使未結(jié)合的酶標(biāo)記物不能*洗脫,，而使最后底物顯色時加深,，造成假陽性或花板。廢液瓶裝滿后應(yīng)及時清空,，以防止廢液回流對管道的污染,，而使洗滌不*，造成花板,。洗板結(jié)束后應(yīng)用蒸餾水*清洗管道,，以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數(shù)及加液量不可*按照試劑說明書設(shè)定,，應(yīng)根據(jù)本實驗室的實際情況來設(shè)定,，開展新項目前，應(yīng)做好驗證工作,，根據(jù)洗滌的效果來決定洗滌的次數(shù)和加液量,。同時應(yīng)根據(jù)儀器維護(hù)保養(yǎng)程序，定期對洗板機(jī)進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng),。
10,、加樣量的準(zhǔn)確與否，直接影響抗原抗體結(jié)合物的濃度,，直至最后顯色的深淺,。吸嘴插入血清不可太深，若插入太深,，吸嘴外壁可能粘連太多血清,，輕微的抖動動即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中，造成交叉污染,。加樣時應(yīng)盡可能的垂直加樣,，并加在包被孔的底部，不可加在孔的上部,。標(biāo)本量大時,，可考慮使用排槍加試劑，可提高速度，但使用排槍時應(yīng)注意吸嘴一定要裝好,，不可松動,，否則會影響加樣量的準(zhǔn)確度。加樣時保持顯色劑不外流,，顯色劑應(yīng)避免接觸金屬器械,。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
11,、加樣時間間隔對結(jié)果也有一定的影響,，在競爭抑制法試驗中，理論上應(yīng)該是標(biāo)本與酶標(biāo)抗體混合后同時加入反應(yīng)孔,，若標(biāo)本先于酶標(biāo)抗體加入反應(yīng)孔,，則標(biāo)本會先與包被抗體進(jìn)行反應(yīng)，造成特異性假陽性,。若是有干擾物質(zhì)存在時表現(xiàn)明顯,，在公平條件下，干擾物質(zhì)與包被抗體的結(jié)合能力會低于標(biāo)本,，而在非公平條件下，干擾物質(zhì)會優(yōu)先與包被抗體進(jìn)行結(jié)合,，出現(xiàn)假陽性,。做HBcAb項目時，若標(biāo)本與酶加樣時間間隔太長,，會引起吸光度的趨勢性變化,，會造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標(biāo)本,，出現(xiàn)假陽性,。
12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,，各種試劑盒的洗液不要混用,。洗液需要稀釋時，應(yīng)按要求稀釋,。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的超純水或雙蒸水,，電導(dǎo)率小于1.5μS/cm,洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其溶解后配制。配制后要測定其pH值,，使其范圍在7.2-7.4之間,。