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逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成,，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素,，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板：

                                                          逆轉(zhuǎn)錄過程

1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種,，包括 Oligo（dT）,、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基,，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對,，可合成全長的 cDNA，但僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA ,，對模板質(zhì)量要求高,，較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基,，可隨機(jī)識別模板并結(jié)合,，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低,，小片段多,，適合后續(xù) qPCR 實(shí)驗(yàn)?；蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列,，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn),，但需合成特定的序列,。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。

2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）,，由兩條肽鏈組成,，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的 RNaseH 活性,，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3,，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙,，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV）,，是單肽鏈的,，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃,，最適 pH7.6,，較弱的  RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。

3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計(jì)檢測純度,，要求A260/280=1.9~2.1,，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度,，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品）,，28S rRNA  條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無 gDNA 和蛋白殘留,。