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  目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法,。該方法具有高效,、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn),。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成,，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸,，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：

1) 用三lv乙酸去除固相載體5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT,，獲得游離的5'-羥基,；

2) 將亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體與活化劑四氮唑混合,，得到核苷亞磷酸活化中間體,，與游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；

3) 由于無法*的5'-羥基都參與縮合,，可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%),，可用乙酸酐和1-甲基咪唑試劑將其終止合成，這種短片段可以在純化時分離掉,；

4) 在氧化劑的作用下,，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更穩(wěn)定,。

經(jīng)過以上四個步驟,，一個脫氧核苷酸就被連接到固相載體上,。重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基連接完成,。合成過程中可以監(jiān)控脫下的保護(hù)基團(tuán)DMT的顏色可以初步判定合成效率,。

引物純化方式選擇：

1、C18柱脫鹽：

有人稱其為簡易反相柱,，它對DNA有特異性的吸附,，可以被有機(jī)溶解洗脫，但不會被水洗脫,，所以能有效地去除鹽分,。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實(shí)際上,，它是一種脫鹽的作用,。這種方法一般不會對普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對于需要用于測序,、克隆的引物不能使用這個級別,。
2、OPC純化： 

OPC純化是根據(jù)DNA保護(hù)基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的DNA片段,。OPC法純化的DNA純度大于95%,。適用于40mer以下引物的純化。
3,、PAGE純：

PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,，對DNA片段進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法,。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法,，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效,。
4,、HPLC純化：

HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進(jìn)行純化,。純度可以大于99%,。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點(diǎn)是成本較高,，批量效率不高,。