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介紹選擇流式抗體技巧
閱讀：968 發(fā)布時(shí)間：2022-8-22流式抗體本身也是抗體,，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件：目標(biāo)蛋白特異性,，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。流式抗體能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)分析或分選大量細(xì)胞,，在血液學(xué),、免疫學(xué),、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,。其純度,、批次穩(wěn)定性、特異性,，以及流式結(jié)果的可重復(fù)性備受重視。
流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種,。在流式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,，盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過(guò)程，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性,。因此在條件允許的范圍內(nèi),，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記。
隨著流式細(xì)胞術(shù)的日益發(fā)展,，流式抗體及熒光標(biāo)記產(chǎn)品的種類,、數(shù)量也在不斷增多,，加上多色分析實(shí)驗(yàn)方案需求的增長(zhǎng)，逐漸產(chǎn)生了抗體難選擇,、熒光難搭配等問(wèn)題,，如何選擇合適的流式抗體,，也成為了流式技術(shù)是否能成功的關(guān)鍵因素之一。下面介紹選擇流式抗體技巧：
一,、滿足抗體具備的基本條件
確定所需檢測(cè)的指標(biāo),，目的細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記或胞內(nèi)標(biāo)記；
根據(jù)檢測(cè)樣本的種屬選擇抗體,，流式抗體基本無(wú)法進(jìn)行種屬交叉反應(yīng)；
根據(jù)抗體的說(shuō)明,，明確是否可以用于流式實(shí)驗(yàn)。
二,、確定所使用儀器的參數(shù)配置
激光器：不同的流式細(xì)胞儀激光器不同,，常見(jiàn)的有405nm,，488nm和635nm，需要根據(jù)具體的儀器進(jìn)行確定,。
濾光片：檢測(cè)通道的多少,，決定最多可以同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)。熒光素的發(fā)射波長(zhǎng)與濾光片有關(guān),，所選擇熒光素要在儀器的可檢測(cè)范圍內(nèi)。
儀器：相同的熒光在不同的儀器上檢測(cè)通道可能不同,，需要參照儀器的說(shuō)明,。
三、熒光的選擇
熒光有強(qiáng)弱之分,，如抗原表達(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光,，如PE、APC,；反之，抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC即可,。常用熒光強(qiáng)弱排序程度為：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC
四,、多色熒光搭配
很多實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)，此時(shí)就需要多個(gè)熒光標(biāo)記進(jìn)行搭配,。流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定的：流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道、需要同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)多少個(gè)指標(biāo),、的抗體有多少種熒光標(biāo)記,。
能檢測(cè)多少通道是又激光決定的需要注意所使用的儀器有哪些激光,。每個(gè)檢測(cè)通道只能選擇1種熒光素，各通道之間的熒光素可以隨意搭配,，檢測(cè)通道不能沖突,。
如果需要做多個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀能檢測(cè)的通道不夠,，首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份,，分別進(jìn)行檢測(cè),。
所選各種熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少，否則將會(huì)導(dǎo)致較大的補(bǔ)償,。例如,，PE-Ccy5與APC同時(shí)標(biāo)記,，將會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)償過(guò)度，需換成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5,。
五,、同型對(duì)照抗體
同型對(duì)照，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色,，類似于陰性對(duì)照，是流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)*的一項(xiàng),。
同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源,、相同亞型及亞鏈,、相同熒光標(biāo)記的免疫球蛋白,，也要求使用相同劑量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1),，同型對(duì)照則為Mouse IgG1-FITC.
如果是純化的一抗加熒光標(biāo)記的二抗,，那么應(yīng)該選擇與一抗相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，如純化的CD3+PE標(biāo)記的二抗,，則對(duì)照為純化的同型對(duì)照+ PE標(biāo)記的二抗。
有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高,，首先檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類型,、劑量等。其次,，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多,，那么同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過(guò)抗體的特異性,，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照,，如空白對(duì)照等。