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PCR反應(yīng)條件為溫度,、時間和循環(huán)次數(shù),。

溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點,。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性,，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃,，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法,， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性,，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1,、變性溫度與時間：

變性溫度低,，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,，93℃～94℃min足以使模板DNA變性,，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高,，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響,。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會導(dǎo)致PCR失敗,。

2,、退火（復(fù)性）溫度與時間：

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合,。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞,。退火溫度與時間,，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長度,。對于20個核苷酸,，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想,。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃）

在Tm值允許范圍內(nèi),， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性,。復(fù)性時間一般為30～60sec,，足以使引物與模板之間*結(jié)合。

3,、延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時,， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合,。PCR延伸反應(yīng)的時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,，延伸時間1min是足夠 的,。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min,。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn),。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些,。