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論述PCR反應(yīng)條件的控制
閱讀：1273 發(fā)布時間：2022-6-28 PCR反應(yīng)條件為溫度,、時間和循環(huán)次數(shù),。
溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三溫度點,。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）,。PCR反應(yīng)條件的控制如下：
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 ,。
2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L,。
溫度與時間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三溫度點,。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）,。PCR反應(yīng)條件的控制如下：
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 ,。
2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L,。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）,。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L,。
6. 反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時間95℃，30 s,。
（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時間72℃,，1 min/kb(10 kb內(nèi)）,。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)。
7. 循環(huán)次數(shù)
一般為25 ～30次,。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量,。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后,，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期",。