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本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中提取具有活性的全蛋白,， 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液

Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細胞,，作用溫和,，提取過程簡便,。獲得的全蛋白可用于 Western Blot,、免疫共沉淀和酶 的活性的測定的等后續(xù)研究,，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑,。 應用方面：可用于 Western Blot,、免疫共沉淀和酶活性測定等后續(xù)研究。

操作步驟

Ⅰ,、實體組織蛋白的提取

1,、在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑，1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF,，混勻,。冰上保存數(shù)分鐘待 用；

2,、 每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中,，手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊,，加入 0.5～1 mL 冷 Lysis Buffer，玻 璃勻漿器上下手動勻漿 15 次,，注意低溫操作,；

3、取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 預冷的離心管,，離心 10000 轉(zhuǎn)/分,，4℃離心 5 min；

4,、取上清轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中,，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford 法,、BCA 法）,；

5、分裝保存于-70℃,避免反復凍融,。

Ⅱ,、培養(yǎng)細胞蛋白提取

1、 貼壁培養(yǎng)的細胞,，吸去培養(yǎng)基后，加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次,，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液,；

2、  懸浮培養(yǎng)的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞,，將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中,，1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min，再用10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS,，1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次,；

3、 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑,，1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF（用戶自配：濃度 100mM,， 溶于異丙醇），混勻,。冰上保存數(shù)分鐘待用,；

4、 在上述培養(yǎng)板或離心管的細胞中,，加入上述配制好的冷 Lysis Buffer,；

5、冷室或冰上操作,，貼壁細胞用細胞刮子刮下,，皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中,；懸浮培養(yǎng)或裂解前刮下的貼壁細胞皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中；

6,、置于 4℃搖床平臺上,，溫和振蕩 15 min；

7,、14,000rpm,，4℃離心 15min，取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford 法,、BCA 法）,；

8、  分裝保存于-70℃,避免反復凍融,。

注意事項：

所有接觸樣品的用具及試劑均需預冷,。我們在提取蛋白后，如有必要,，可透析除去表面活性劑,。