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科研實(shí)驗(yàn)中要使ELISA試劑盒測(cè)定得到準(zhǔn)確的結(jié)果,，不論是定性的還是定量的,，必須嚴(yán)格按照規(guī)定的方法制備試劑和實(shí)施測(cè)定,。一般性試劑,，如包被緩沖液,、洗滌液、標(biāo)本稀釋液,、結(jié)合物稀釋液,、底物工作液和酶反應(yīng)終止液等，配制時(shí)不可掉以輕心,。

　　(一)加樣

　　在ELISA試劑盒中除了包被外,，一般需進(jìn)行45加樣。在定性測(cè)定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性,，例如規(guī)定為加樣一滴,。此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢(shì),，使每滴液體的體積基本相同,。在定量測(cè)定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制,。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底,，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡,。

　　(二)保溫

　　在ELISA試劑盒中一般有二次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求,，保溫容器zui好是水浴箱,，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起,。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中,。濕盒應(yīng)該是金屬的,，傳熱容易。如用保溫箱,，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中,，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要,。加入底物后,，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20℃,，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,，以便不時(shí)觀察,，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)

　　(三)洗滌

　　洗滌在ELISA試劑盒過(guò)程中不是反應(yīng)聚,，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的,。因此在ELISA試劑盒測(cè)定的反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附,，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯一類(lèi)物質(zhì)即右達(dá)到此目的,。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑,。根據(jù)脂肪酸的種類(lèi)而對(duì)聚山梨酯編號(hào),，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中zui為常用,。它的洗滌效果好,，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。

　　洗滌如不*,，特別在zui后一次,，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高,。另外,，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾,。

　　ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液;②將洗滌液注滿板孔;③放置2min,，略作搖動(dòng);④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干,。洗滌的次數(shù)一般為3～4次,，有時(shí)甚至需洗5～6次。

　　(四)比色

如陰性對(duì)照顏色極淺,，在定性測(cè)定中一般可采用目視比色。如用比色計(jì)測(cè)定結(jié)果,，準(zhǔn)確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量,。