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我們都知道,，細(xì)胞如果要長(zhǎng)期保存,，需要凍存起來(lái)放液氮保存,。那怎么樣凍存細(xì)胞才能保證細(xì)胞能正常復(fù)蘇,，不至于凍存死亡呢？下面我們就來(lái)講講細(xì)胞凍存應(yīng)該注意的一些地方,。

1. 保持凍存前細(xì)胞狀態(tài)良好

凍存前一定要保證細(xì)胞狀態(tài)良好,，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，否則不管后面怎么處理,，凍存后的細(xì)胞狀態(tài)必然有影響,。若細(xì)胞密度偏高，培養(yǎng)基已經(jīng)略微變黃,，細(xì)胞狀態(tài)正常,，需要換液培養(yǎng)2h以上再凍存細(xì)胞；若已*變黃,，細(xì)胞死亡超過(guò)20%,，需要傳代后再重新培養(yǎng)至狀態(tài)正常后再凍存細(xì)胞。

2. 消化,、吹打細(xì)胞按盡量輕柔
如何正確消化,、吹打細(xì)胞在前面已經(jīng)講過(guò)了，有興趣的話(huà)可以到以往文章里看看,，這里就不再贅述了,。凍存后細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿肯定還是會(huì)殘留一點(diǎn)細(xì)胞，這些殘留的細(xì)胞加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),，如果培養(yǎng)正常就可以看出凍存時(shí)消化,、吹打操作是沒(méi)有問(wèn)題的，如果直接死了或者狀態(tài)不好,，那凍存的細(xì)胞自然也好不到哪里去,，問(wèn)題出在哪就很明顯了。

3. 凍存液配方要給合適的
凍存液配方這個(gè)其實(shí)不同實(shí)驗(yàn)室都有自己的習(xí)慣,，有FBS+10%DMSO的,，也有*培養(yǎng)基+10%DMSO的,，還有基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清+DMSO=7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以說(shuō)是五花八門(mén),，但總體來(lái)說(shuō),，DMSO一般是不超過(guò)12%的，血清濃度越高凍存效果也越好,，因此需要多凍幾次對(duì)比合適的配方,。

4. 凍存液要提前配置
凍存液使用時(shí)要提前配好，不能直接在細(xì)胞懸液中加DMSO凍存細(xì)胞,，否則DMSO溶解時(shí)濃度不均加上溶解放熱會(huì)損傷細(xì)胞活性,。可以現(xiàn)配先用,，也可以多配一點(diǎn),，4度最多可以保存3個(gè)月，-20度可以保存一年,。細(xì)胞用凍存液重懸后應(yīng)盡快放到4度或者程序性?xún)龃婧虚_(kāi)始凍存,，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫狀態(tài)，因?yàn)槭覝貤l件下DMSO對(duì)細(xì)胞是有害的,。

5. 凍存細(xì)胞數(shù)量選擇
通常來(lái)說(shuō),，凍存細(xì)胞都會(huì)有一部分細(xì)胞死亡，所以?xún)龃媸Ｏ碌幕罴?xì)胞數(shù)量才是決定細(xì)胞復(fù)蘇后能否正常養(yǎng)起來(lái)的關(guān)鍵,。一般凍存不容易死的細(xì)胞數(shù)量每管在100-200萬(wàn)就夠了,，一些凍存很容易死的細(xì)胞，比如NK92,、THP-1,、SF9等細(xì)胞數(shù)量要稍微高點(diǎn)，300-400萬(wàn)左右為宜,。凍存液一般1ml左右每管,，這個(gè)基本每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都差不多。

6. 凍存程序選擇
凍存的時(shí)候可以選擇用程序性?xún)龃婧兄苯臃诺?80度凍存細(xì)胞,，但要記得異丙醇要及時(shí)更換,，一般用4-5次異丙醇含水量就超標(biāo)了,，不再適合凍存細(xì)胞使用,。也可以將凍存管依次在4度10min，-20度2h,，-80過(guò)夜后液氮保存,。-80度不適合細(xì)胞長(zhǎng)期保存，只能短期保存,，最好不要超過(guò)一周,，否則有部分細(xì)胞系活性可能會(huì)下降很厲害,，長(zhǎng)期保存的細(xì)胞最好放液氮罐保存。

7. 注意凍存檢查
凍存細(xì)胞后應(yīng)在同一批次內(nèi)隨機(jī)選一只細(xì)胞復(fù)蘇檢測(cè)凍存效果,， 如果復(fù)蘇效果不佳的話(huà)需要找到問(wèn)題所在摸索合適條件重新凍存細(xì)胞,，如果復(fù)蘇良好的就可以放到液氮里長(zhǎng)期保存了。這個(gè)也是前面推薦將凍存剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的原因,，可以有效避免細(xì)胞凍存失敗導(dǎo)致絕種