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講解質(zhì)粒抽提步驟
閱讀:2925 發(fā)布時(shí)間:2021-9-2質(zhì)粒抽提(Plasmid Extraction)方法即去除 RNA,,將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開(kāi),,去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì),以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒,。提取質(zhì)粒DNA的方法有很多種,,從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取,、大量提取,,從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取,從具體操作方法分可以分為堿裂解法,、煮沸法,、牙簽法等,各種不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn),,根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢圆捎煤线m的提取方法,。
Ⅰ.使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒時(shí)請(qǐng)參考具體試劑盒的操作說(shuō)明。如Omega公司的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin (質(zhì)粒提取盒),。
Ⅱ.堿裂解手提法:此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取,,提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析,。方法如下:
1,、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2mlLB培養(yǎng)基。
2,、37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,。
3、取1.5ml菌體于Ep管(離心管),,以4000rpm離心3min,,棄上清液。
4,、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,,50mM/LEDTApH8.0,25mM/LTris-HClpH8.0)充分混合,。
5,、加入0.2ml溶液II(0.2mM/LNaOH,1%SDS),,輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,,置于冰浴5min.
6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5mol/LKAc,,pH4.8),,輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,置于冰浴5min.
7,、以10,,000rpm離心20min,取上清液于另一新Ep管
8,、加入等體積的異丙醇,,混勻后靜置10min.
9、以10,,000rpm離心20min,棄上清,。
10,、用70%乙醇0.5ml洗滌一次,抽干所有液體,。
11,、待沉淀干燥后,溶于50ulTE緩沖液中(或60℃溫育去離子水)