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技術(shù)文章

禽波氏桿菌PCR試劑盒注意事項與原則

閱讀:1406          發(fā)布時間:2021-4-13

禽波氏桿菌PCR試劑盒注意事項:

①加入試劑的順序應(yīng)*,,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣,。

②使用干凈的塑料容器配置洗滌液,。

③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測試劑盒說明書中標(biāo)明的時間,、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作,。

④底物A應(yīng)揮發(fā),,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,,避免長時間暴露于光下,。避免用手接觸,有毒,。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值,。

⑤洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水,。

⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染,,吸取終止液和底物A,、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器 ,。

⑦實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,,密封保存,以免變質(zhì),。

⑧試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,,不可保存,。

⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。

禽波氏桿菌PCR試劑盒原則:

①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右,。

②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC機(jī)分布,,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),,特別是3'端的互補(bǔ),,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。

⑤引物3'端的堿基,,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點,, 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。

⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

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