化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
基因探針法PCR試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn)6要素
閱讀：1583 發(fā)布時間：2020-12-2基因探針法PCR試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn)：
1. 一管式操作,，用戶只需要提供樣品即可。
2. 根據(jù)大豆熱休克蛋白基因保守區(qū)域設(shè)計引物，能專一性檢測出樣品中的大豆成分,，但不能檢測其他非大豆成分。
3. 快速,，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時,。
4. 只需要普通 PCR 儀和凝膠電泳儀，無需配置貴重儀器設(shè)備,。
5. 對混合樣品中大豆成分的檢測下限為 0.1%,，對樣品中大豆成分的核酸檢測下限為 1.0ng/μL。
6. 本只能用于科研,，足夠 50 次 40uL 體系的常規(guī) PCR,。
基因探針法PCR試劑盒五要素：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右,。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3'端的互補(bǔ),，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。
⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),， 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。
基因探針法PCR試劑盒操作步驟：
1.液氮充分研磨樣品。
2.收集研磨成粉末的50mg樣品,，置于1.5ml離心管中,。
3.加入350μl65℃預(yù)熱的緩沖液IL，并加入20μl蛋白酶K劇烈地漩渦振蕩,，確保所有的組織團(tuán)都分散均勻,。
4.65℃水浴20-30min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次,。
5.加入350μl,，充分混勻，12,000 rpm(~13,400×g)離心5分鐘,。
6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml離心管中,。注意確保不要打散沉淀團(tuán)或把組織碎片也一起轉(zhuǎn)移。
7.加入4μl RNase A,，渦旋混勻,。室溫放置2min。
8.加入二分之一上清體積的緩沖液IB與等體積的無水乙醇,，充分混勻,。如：向300μl上清中加入150μl緩沖液IB與300μl無水乙醇。
9.把上述混勻基因探針法PCR試劑盒的液體轉(zhuǎn)移到吸附柱上,。10,000×g離心1 min以結(jié)合DNA,，棄去濾出液體。純化柱*容量為750μl,如果混合液大于750μl,請分兩次過柱,。
10.將吸附柱重新套回收集管中,，加入500μl緩沖液WB至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液,；
11.將吸附柱重新套回收集管中,，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液,；