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技術(shù)文章

檢測ATCC細(xì)胞

閱讀:2083          發(fā)布時(shí)間:2018-11-2

 

用了許多方法檢測小鼠的肝臟,、腦部,、睪丸等組織的細(xì)胞凋亡,其中 TUNEL 法做的多,,我購買的試劑盒主要是 roche,、 promega 公司,結(jié)果大多數(shù)成功,,偶爾也有失敗,,下面我把實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵問題與大家共享一下,同時(shí)也希望能對初學(xué)者有所幫忙,。

ATCC細(xì)胞 TUNEL實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵步驟

1.充分脫蠟和水化

脫蠟可以先 60oC 20 min,;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分,、均勻,;

2.把握好細(xì)胞通透的時(shí)間

一般根據(jù)切片的厚薄,選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間,,常用 10-30 min,,幾 μm 切片用短時(shí)間,;幾十 μm 切片用長時(shí)間,通過摸索達(dá)到既不脫片,,有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi),。

3.適當(dāng)延長 TUNEL 反應(yīng)液的時(shí)間

一般是37oC 1 h,你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度,,選擇更長的時(shí)間,,可長至 2 h,但要結(jié)合你終的背景著色,。

4.DAB 顯色條件的選擇

一般 DAB 反應(yīng)10 min 左右,,結(jié)合鏡下控制背景顏色,長不超過 30 min,;promega 公司提供的 DAB 液(桃紅色),,不利于辨認(rèn)棕褐色,我不太喜歡,。

5.PBS 的充分清洗

在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格,,可增加次數(shù)達(dá) 5 次,因?yàn)檫@些清洗直接決定后切片的非特異性著色,。

6.內(nèi)源性 POD 的封閉

對于肝臟,、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織,我的經(jīng)驗(yàn)是適當(dāng)延長封閉時(shí)間和升高過氧化氫的濃度,,可以達(dá)到很好的封閉效果,,且不影響終的特異性染色。

TUNEL法的實(shí)驗(yàn)原理

      ATCC細(xì)胞 基本原理:對不同組織切片先增加細(xì)胞膜通透性,,然后讓 rTDT 和生物標(biāo)記的 dTUTP 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),,在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3’-OH 結(jié)合,再用 HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結(jié)合(每個鏈霉親和素至少可以再結(jié)合 3 個 biotin 分子),,后用 DAB,、過氧化氫與 SP 上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng),,形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色,,終通過計(jì)數(shù)每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細(xì)胞的比例來判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。(小編碎碎念:掌握原理是做好實(shí)驗(yàn)的先決條件,,不少人還以為是抗體抗原反應(yīng)呢)

       細(xì)胞通透的時(shí)間選擇

       1.蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜,,從而使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng),提高陽性率,。但濃度過高或孵育時(shí)間太長容易脫片,,只要不脫片,好像影響不大,,其作用類似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑,。

       2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml,,可用 PBS 配制,也可用蛋白酶K緩沖液(100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA),;然后分裝成小份,,用完一支再用下一支,-20oC保存 1 個月應(yīng)該沒問題的(重復(fù)拿的那支),,而一直冷凍的至少可以用半年以上,。

       3. 蛋白酶K反應(yīng)時(shí)間一般為10-30 min,具體時(shí)間長短與切片厚薄有關(guān),,4 μm左右的片子可以用 10 min,,但30 μm左右的可用30 min,終通過摸索jia時(shí)間,。過長易脫片,、過短起不到通透效果。

關(guān)鍵試劑操作條件

       DAB 顯色反應(yīng)大約需要10 min,,要控制好反應(yīng)時(shí)間,,勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度,、試劑盒種類不同來摸索一下,。

蛋白酶K工作液處理時(shí)間,、溫度須在范圍內(nèi)摸索,,溫度過高,時(shí)間過長,,易破壞核酸結(jié)構(gòu),,出現(xiàn)假陽性。

       DNase 1 一般室溫,,10 min 即可,。

 如何減弱非特異性染色

       若是肝臟或腎臟,因富含內(nèi)源性過氧化物酶,,需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時(shí)間,。其他還可以加強(qiáng)滅活、縮短 DAB 孵育時(shí)間,、PBS 充分清洗,,注意鏡下把握好著色。

其他注意事項(xiàng)

       1.濕盒用帶蓋方盤,,里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片,,使用時(shí)稍加水即可。

       2.英文說明書中對組織細(xì)胞通透這一步中,,加了“對難處理的組織的處理”,,意思是用常規(guī)方法處理(如蛋白酶 K)后,,應(yīng)該陽性而做不出陽性時(shí),可用微波修復(fù),。

       3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu),,以利于結(jié)果分析,石蠟切片常用蘇木素,,核染成蘭色,,冷凍切片常用甲基綠,核染成綠色,。

       4.PBS 用蒸餾水,、Na2HPO4、KH2PO4配制,,現(xiàn)在有賣的,,自己加蒸餾水稀釋后即可用,很方便,,也不貴,。蛋白酶 K 消化蛋白后,需要用封閉液,。

       5. 未打開的試劑盒貯存在-20℃(-15~25℃),;converter -POD液一旦解凍,以后就保存在4℃(2~8℃)下,,至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定,,避免再次凍存;TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后,,放至冰上直至使用,。

       6. 結(jié)果分析時(shí)注意:在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DNA斷,從而引起假陽性結(jié)果,;而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,,以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果

       7.棕色是陽性細(xì)胞沒錯,;棕色+藍(lán)色的細(xì)胞核為藍(lán)黑色,,趨黑色,所以是可以判斷的,。如果結(jié)果片子全是藍(lán)色的,,那就是說沒有陽性細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)失敗,。陽性細(xì)胞核可以被染上,,只不過是藍(lán)黑色而已。注意分辨。Tunel后鏡檢一下看看陽性細(xì)胞核在什么位置,;然后再輕度復(fù)染即可,。注意比較分辨哪些是陽性細(xì)胞。

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