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檢測ATCC細胞
閱讀：1987 發(fā)布時間：2018-11-2
用了許多方法檢測小鼠的肝臟,、腦部,、睪丸等組織的細胞凋亡，其中 TUNEL 法做的多,，我購買的試劑盒主要是 roche,、 promega 公司，結(jié)果大多數(shù)成功,，偶爾也有失敗,，下面我把實驗中的關(guān)鍵問題與大家共享一下，同時也希望能對初學(xué)者有所幫忙,。
ATCC細胞 TUNEL實驗中關(guān)鍵步驟
1.充分脫蠟和水化
脫蠟可以先 60oC 20 min,；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻,；
2.把握好細胞通透的時間
一般根據(jù)切片的厚薄,，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min,，幾 μm 切片用短時間,；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達到既不脫片,，有能夠使后面的酶和抗體進入胞內(nèi),。
3.適當延長 TUNEL 反應(yīng)液的時間
一般是37oC 1 h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度,，選擇更長的時間,，可長至 2 h，但要結(jié)合你終的背景著色,。
4.DAB 顯色條件的選擇
一般 DAB 反應(yīng)10 min 左右,，結(jié)合鏡下控制背景顏色，長不超過 30 min,；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色）,，不利于辨認棕褐色，我不太喜歡,。
5.PBS 的充分清洗
在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴格,，可增加次數(shù)達 5 次，因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著色,。
6.內(nèi)源性 POD 的封閉
對于肝臟,、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經(jīng)驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度,，可以達到很好的封閉效果,，且不影響終的特異性染色。
TUNEL法的實驗原理
ATCC細胞 基本原理：對不同組織切片先增加細胞膜通透性,，然后讓 rTDT 和生物標記的 dTUTP 進入細胞內(nèi),，在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3’-OH 結(jié)合，再用 HRP 標記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結(jié)合（每個鏈霉親和素至少可以再結(jié)合 3 個 biotin 分子）,，后用 DAB,、過氧化氫與 SP 上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng),，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色,，終通過計數(shù)每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發(fā)生情況。（小編碎碎念：掌握原理是做好實驗的先決條件,，不少人還以為是抗體抗原反應(yīng)呢）
細胞通透的時間選擇
1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜,，從而使反應(yīng)試劑充分進入細胞核進行反應(yīng),，提高陽性率。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片,，只要不脫片，好像影響不大,，其作用類似與 TritonX100 等細胞通透劑,。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制,，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）,；然后分裝成小份，用完一支再用下一支,，-20oC保存 1 個月應(yīng)該沒問題的（重復(fù)拿的那支）,，而一直冷凍的至少可以用半年以上。
3. 蛋白酶K反應(yīng)時間一般為10-30 min,，具體時間長短與切片厚薄有關(guān),，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min,，終通過摸索jia時間,。過長易脫片、過短起不到通透效果,。
關(guān)鍵試劑操作條件
DAB 顯色反應(yīng)大約需要10 min,，要控制好反應(yīng)時間，勿使背景顏色過深,。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度,、試劑盒種類不同來摸索一下。
蛋白酶K工作液處理時間,、溫度須在范圍內(nèi)摸索,，溫度過高，時間過長,，易破壞核酸結(jié)構(gòu),，出現(xiàn)假陽性。
DNase 1 一般室溫,，10 min 即可,。
如何減弱非特異性染色
若是肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過氧化物酶,，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間,。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時間,、PBS 充分清洗,，注意鏡下把握好著色,。
其他注意事項
1.濕盒用帶蓋方盤，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片,，使用時稍加水即可,。
2.英文說明書中對組織細胞通透這一步中，加了“對難處理的組織的處理”,，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后,，應(yīng)該陽性而做不出陽性時，可用微波修復(fù),。
3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu),，以利于結(jié)果分析，石蠟切片常用蘇木素,，核染成蘭色,，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色,。
4.PBS 用蒸餾水,、Na2HPO4、KH2PO4配制,，現(xiàn)在有賣的,，自己加蒸餾水稀釋后即可用，很方便,，也不貴,。蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液,。
5. 未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）,；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下,，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定,，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后,，放至冰上直至使用,。
6. 結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產(chǎn)生大量DNA斷，從而引起假陽性結(jié)果,；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不*,，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反應(yīng)，進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果
7.棕色是陽性細胞沒錯,；棕色+藍色的細胞核為藍黑色,，趨黑色，所以是可以判斷的,。如果結(jié)果片子全是藍色的,，那就是說沒有陽性細胞核,。實驗失敗。陽性細胞核可以被染上,，只不過是藍黑色而已,。注意分辨。Tunel后鏡檢一下看看陽性細胞核在什么位置,；然后再輕度復(fù)染即可,。注意比較分辨哪些是陽性細胞。