冷凍干燥機如何對菌種進行保藏

江蘇恒敏儀器冷凍干燥機主要部件分為干燥箱,、凝結(jié)器,、冷凍機組、真空泵,、加熱/冷卻裝置等,。凍干機起源于19世紀(jì)20年代的真空冷凍干燥技術(shù)，后真空凍干技術(shù)除了在醫(yī)藥上有著廣泛應(yīng)用,，在生物制品,、食品、血液制品,、活性物質(zhì)領(lǐng)域之外的領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用,。下面小編為大家介紹下微生物菌種的冷凍干燥保藏操作流程：
 凍干機適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌,、病毒,、噬菌體、立克次體,、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏,，但不適于霉菌的菌絲型、菇類,、藻類和原蟲等,。其操作流程如下：
 1、安瓿管準(zhǔn)備
 安瓿管材料以中性玻璃為宜,。清洗安瓿管時,，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后,，用蒸餾水浸泡至pH中性,，干燥后、貼上標(biāo)簽,，標(biāo)上菌號及時間,，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘,，備用,。
 2、保護劑的選擇和準(zhǔn)備
 保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇,。配制保護劑時,，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法,。如血清,，可用過濾滅菌,；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂,，一般在100℃間歇煮沸2-3次,，每次10-30分鐘，備用,。
 3,、凍干樣品的準(zhǔn)備
 在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行)),，與保護劑混合均勻,，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例,，為了取得每毫升1010個活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升,，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細(xì)滴管,，直接滴入安瓿管底部,，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升,，若是球形安瓿管,，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物,，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基,，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中,。分裝安瓿管時間盡量要短,，在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作,。
 4、預(yù)凍
 一般預(yù)凍2小時以上,，溫度達到-20℃到-35℃左右,。
 5、冷凍干燥
 采用凍干機進行冷凍干燥,。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內(nèi),，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時,。
 終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：
 安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀,；
 真空度接近空載時的zui高值；
 樣品溫度與管外溫度接近,；
 選用1-2支對照管,，其水份與菌懸液同量,，視為干燥完結(jié)；
 選用一個安瓿管,，裝1-2%氯化鈷,，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié),；
 冷凍干燥完畢后,，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用,。
 6,、真空封口及真空檢驗
 將安瓿管頸部用強火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空,，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封,。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
 7,、保藏
 安瓿管應(yīng)低溫避光保藏,。
 8、質(zhì)量檢查
 冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標(biāo)檢查,，如存活率,、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異,、雜菌污染等,。新版GMP附錄1第三章第十一條規(guī)定應(yīng)當(dāng)對各個潔凈級別的微生物進行動態(tài)監(jiān)測，以評估無菌生產(chǎn)的微生物狀況,。其中監(jiān)測方法包含沉降菌法,、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法等。與此同時,，新版GMP更強調(diào)在關(guān)鍵操作的全過程均應(yīng)該對*潔凈區(qū)進行懸浮粒子和微生物監(jiān)測,。使灌裝與凍干區(qū)域相連接的半自動進出料裝載機構(gòu)以L型布局形式出現(xiàn)，與以往的老式凍干機的大開門式相比較,，因良好的隔離操作,，環(huán)境控制更趨向于理性的數(shù)據(jù)控制，且無菌控制的可信度大大增加,，L型布局的合理設(shè)計使*區(qū)域更集中,，在環(huán)境監(jiān)測時，監(jiān)測點也更容易把握,，便于實施,。