聯系電話
賽爾瑞成（北京）生命科學技術有限公司
中級會員·8年
- 聯系人：
- 尤女士
- 電話：
- 010-57325063
- 手機：
- 18513354055
- 傳真：
- 010-57325063
- 地址：
- 北京市昌平區(qū)超前路甲1號北控宏創(chuàng)科技園5號樓6層
掃一掃訪問手機商鋪
化學感受態(tài)細胞是常規(guī)克隆和亞克隆實驗應用較為合適的解決方案,。經氯化鈣處理，促進質粒DNA黏附于感受態(tài)細胞膜上,。將感受態(tài)細胞通過水浴熱激,，使細胞膜孔打開，從而質?？梢赃M入,。
操作方法：（以下操作均按無菌條件的標準進行）
1、取感受態(tài)細胞置于冰浴中,，如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中,，置于冰浴中。一次轉化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100μl,，可以根據實際情況分裝使用,。應注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。
以下實驗以100μl感受態(tài)細胞為例,。
2,、向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA（50μl的感受態(tài)細胞能夠被1ng超螺旋質粒DNA所飽和），輕輕旋轉離心管以混勻內容物,，在冰浴中靜置30分鐘,。
3、將離心管置于42℃水浴中放置90秒,，然后快速將管轉移到冰浴中,，使細胞冷卻2-3分鐘，該過程不要搖動離心管,。
4,、向每個離心管中加入500μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘（150轉/分鐘）,，目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,，使菌體復蘇。
5,、將離心管內容物混勻,，吸取100μl已轉化的感受態(tài)細胞加到含相應抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細胞均勻涂開,。將平板置于室溫直至液體被吸收,，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時,。
注：涂布用量可根據具體實驗來調整,。如轉化的DNA總量較多，可取更少量轉化產物涂布平板,；反之,，如轉化的DNA總量較少,，可取200-300μl轉化產物涂布平板。如果預計的克隆較少,，可通過離心（4,000rpm,2分鐘）后吸除部分培養(yǎng)液,，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存,，如果次日的轉化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）
注意事項：
1.進行轉化操作時,，應根據相應溫度及無菌條件的要求進行。
2.感受態(tài)細胞應保存在-70℃,，不可多次凍融和放置時間過長,，以避免感受態(tài)細胞的轉化效率。
3.為防止轉化實驗不成功,，可以保留部分連接反應液,，以重新轉化，將損失降到很低的程度,。
