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摘要：將 Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色譜柱與 Agilent 6545 Q-TOF LC/MS 結(jié)合使用,，對(duì)六天內(nèi)采集的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的養(yǎng)分吸收和分泌廢物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 HILIC-Z 色譜柱可保持良好的峰形與保留時(shí)間重現(xiàn)性,，能適應(yīng)高鹽樣品（如細(xì)胞培養(yǎng)基）。該方法通過優(yōu)化流動(dòng)相,、梯度和儀器參數(shù),，可用于在負(fù)離子模式下的單次分析運(yùn)行中對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的養(yǎng)分（即葡萄糖和氨基酸）與代謝廢物（即乳酸及 TCA 循環(huán)相關(guān)的其他有機(jī)酸）進(jìn)行監(jiān)測(cè),。

前言：質(zhì)譜 (MS) 是一種高靈敏度分析技術(shù)，常用于針對(duì)各種小分子的代謝組學(xué)研究1 ,。哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝組學(xué)一躍成為在多個(gè)研究領(lǐng)域中具備應(yīng)用潛力的新興工具，研究細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞消耗與分泌的多種代謝物變得越來(lái)越重要2,3,。分析仍然面臨一些挑戰(zhàn),，包括陰離子代謝物的保留4 ,、樣品基質(zhì)效應(yīng)5 ,，以及螯合有機(jī)酸和磷酸化合物的分析性能6 ,。為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，開發(fā)了一種穩(wěn)定且可重現(xiàn)的親水相互作用色譜 (HILIC) LC/MS 方法,，方法中采用 InfinityLab 去活劑添加劑作為流動(dòng)相改性劑，以增強(qiáng)金屬螯合有機(jī)酸和磷酸化分析物的峰形和檢測(cè)信號(hào)。作為色譜優(yōu)化與 HILIC 色譜柱測(cè)試的一個(gè)步驟，對(duì)樣品基質(zhì)中鹽濃度的影響進(jìn)行了研究,。研究中建立了一種分析細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中代謝物消耗和分泌的方法。

實(shí)驗(yàn)部分：方法耐鹽性研究：為進(jìn)行 HILIC LC/MS 方法開發(fā)，選擇了一套涵蓋磷酸化分析物與磷酸糖異構(gòu)體的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品,。使用 Milli-Q 純化水配制 5 mg/mL 的分析物儲(chǔ)備液,。然后用 80:20 的乙腈 (ACN)/水將儲(chǔ)備液稀釋為 1 ng/µL (ppm) 的樣品,。在實(shí)驗(yàn)中,，配制一份高鹽儲(chǔ)備液（4 mol/L 尿素和 2 mol/L  氯化鈉 (NaCl) 水溶液）作為鹽加標(biāo)樣,。將高鹽溶液按 20% （80 mmol/L 尿素,、40 mmol/L NaCl）與 40%（160 mmol/L 尿素、80 mmol/L NaCl）加標(biāo)至代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 (3 ng) 中,。因?yàn)辂}不溶于樣品基質(zhì) (80% ACN),，因此沒有嘗試采用更高的鹽濃度 (> 40%),。細(xì)胞培養(yǎng)研究：在添加 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng) K562 白血病細(xì)胞,。立即（第 0 天）,、24 小時(shí)（第 1 天）、48 小時(shí)（第 2 天）,、72 小時(shí)（第 3 天）或 6 天（第 6 天）后采集部分細(xì)胞和培養(yǎng)基,。將樣品在 250 × g 條件下離心 5 分鐘，使細(xì)胞形成團(tuán)塊,。將生長(zhǎng)培養(yǎng)基 (100 µL) 轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管,，與 400 µL 50% ACN 混合，再在 10000 × g 條件下離心 5 分鐘,。然后,，對(duì) 1 µL 上清液進(jìn)行 HILIC LC/MS 分析。使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件分析結(jié)果,。

分析物分離：在 InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, 2.1 mm × 50 mm, 2.7 µm, PEEK 內(nèi)襯（部件號(hào) 679775-924）色譜柱上進(jìn)行色譜分離,。首先配制一份 10 倍流動(dòng)相緩沖儲(chǔ)備液（100 mmol/L 乙酸銨， pH 9.0）水溶液,，然后用水（A 溶液）或 ACN（B 溶液）配制 1 倍溶劑,。在水溶液和有機(jī)流動(dòng)相中添加 InfinityLab 去活劑添加劑（部件號(hào) 5191-4506），確保濃度在梯度洗脫過程中保持不變,。儀器使用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜儀與配備安捷倫噴射流離子源的 Agilent 6545 Q-TOF 的聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行 LC/MS 分析,。液相色譜儀包括： • 帶清洗密封墊的 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • 帶柱溫箱 (G1330B) 的 Agilent 1290 Infinity 自動(dòng)進(jìn)樣器 (G4226A) • 安捷倫柱溫箱 (G1316C) 通過連續(xù)注入?yún)⒈荣|(zhì)量溶液，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)質(zhì)量軸校準(zhǔn),。表 1 和表 2 匯總了優(yōu)化的 LC 和 MS 條件。使用 Agilent MassHunter 軟件套件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析,。

結(jié)果與討論：利用 InfinityLab Poroshell HILIC-Z 色譜柱寬范圍的 pH 穩(wěn)定性與高分離度,，開發(fā)了一種簡(jiǎn)單而穩(wěn)定的 HILIC LC/MS 方法,。在本研究中,，pH 9.0 的流動(dòng)相在色譜分離中獲得了整總體結(jié)果,。此外，添加 InfinityLab 去活劑添加劑明顯改善了鰲合有機(jī)酸與磷酸化合物的峰形,，同時(shí)增強(qiáng)了信號(hào)強(qiáng)度,。在 DMEM 與 RPMI 1640 這兩種常用的培養(yǎng)基中，含有的高濃度無(wú)機(jī)鹽包括（NaCl,，約 100 mmol/L）,、（KCl，約 5 mmol/L）和硝酸鈣（Ca(NO3)2,，約 0.4 mmol/L）,。這些無(wú)機(jī)鹽可保持培養(yǎng)基滲透平衡，并有助于調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的膜電位,。為確定鹽對(duì)保留時(shí)間重現(xiàn)性與代謝物峰形的影響,，我們使用 HILIC LC/MS 方法對(duì)濃度增加的尿素和 NaCl 加標(biāo)樣品進(jìn)行分析（圖 1）,。結(jié)果表明,，HILIC 色譜柱保持了保留時(shí)間重現(xiàn)性，同時(shí)高鹽樣品中的目標(biāo)核苷酸（如 AMP,、ADP、ATP 和 GTP）與磷酸糖異構(gòu)體（如葡萄糖-1-磷酸鹽和葡萄糖-6-磷酸鹽）檢測(cè)到極小的離子抑制（圖 1）,。

 

接下來(lái)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基在六天時(shí)間內(nèi)的養(yǎng)分消耗與代謝物分泌（圖 2）。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,，乳酸作為代謝廢物，隨時(shí)間推移而逐漸積累（圖 3,，第 1 列）,。此外,，在監(jiān)測(cè)過程中，有關(guān) TCA 循環(huán)的其他有機(jī)酸（即蘋果酸,、α-酮戊二酸 (α-KG),、谷氨酸和檸檬酸）在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分泌并逐漸累積（圖 3）。相比之下,，細(xì)胞在代謝過程中消耗了糖,，因此葡萄糖濃度隨時(shí)間推移逐漸降低（圖 3，第 2 列）,，直至*耗盡（圖 3,，第 2 列，第 6 天）,。氨基酸濃度也隨時(shí)間推移而逐漸降低,，這是因?yàn)榧?xì)胞消耗了生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的養(yǎng)分（圖 4）。結(jié)果表明,，在單次 HILIC LC/MS 運(yùn)行中,，可對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中包括有機(jī)酸與氨基酸在內(nèi)的各種代謝物進(jìn)行分析和監(jiān)測(cè)。