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離子色譜法測(cè)定氯膦酸二鈉及其制劑 的含量和有關(guān)物質(zhì)
閱讀：829 發(fā)布時(shí)間：2019-5-15氯膦酸二鈉(Clodronate Disodium,，CD)又名氯屈膦酸二鈉，為代雙 膦酸鹽類(lèi)化合物,，是近20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的抗代謝性骨病的一類(lèi)新藥,。多年臨 床研究表明，氯膦酸二鈉療效穩(wěn)定,，副作用較少,，是控制骨溶解、修復(fù)溶骨 病灶,、減少病理性骨折產(chǎn)生的經(jīng)典藥物之一,。《中國(guó)藥典》2010年版擬收載 該品種,。
氯膦酸二鈉分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)膦酸基團(tuán),，極性強(qiáng)，易電離,，不能在反 相液相色譜柱上保留,；而且結(jié)構(gòu)中沒(méi)有發(fā)色基團(tuán)，不能用常規(guī)的紫外和熒光 檢測(cè)器測(cè)定,。目前,，該藥物的分析方法有容量分析法[1-4]、柱前或柱后衍生離 子色譜法[5-8]分析,。國(guó)家現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中原料和制劑的含量測(cè)定采用容量分 析法,，需先破壞氯膦酸二鈉結(jié)構(gòu)產(chǎn)生氯離子，再用硝酸銀滴定,，不僅專(zhuān)屬性 差,，而且操作復(fù)雜[1-3]。有國(guó)外文獻(xiàn)[9]和進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)[10]用抑制電導(dǎo)型離子 色譜方法測(cè)定氯膦酸二鈉注射液有關(guān)物質(zhì)的方法,。例如,，進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn) 采用離子色譜方法測(cè)定氯膦酸二鈉注射液的有關(guān)物質(zhì)[10]，但含量測(cè)定則用與 有關(guān)物質(zhì)檢查*不同的色譜方法,，需柱后衍生后用紫外光譜檢測(cè),，裝置復(fù) 雜，設(shè)備繁多[10,11]。有關(guān)同時(shí)測(cè)定氯膦酸二鈉含量及其有關(guān)物質(zhì)的分析方法 尚未見(jiàn)報(bào)道,。
離子色譜法是一種分析無(wú)機(jī)和有機(jī)陰,、陽(yáng)離子的重要技術(shù)，是普通液相和 氣相色譜分析離子型藥物的重要補(bǔ)充,，在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增多[12-14],。 本研究用抑制電導(dǎo)型離子色譜法同時(shí)測(cè)定氯膦酸二鈉及其制劑的含量和有關(guān) 物質(zhì)。
測(cè)試條件
儀器：賽默飛ICS系列離子色譜帶淋洗液發(fā)生罐系統(tǒng),。 分析柱: IonPac AS11-HC+IonPac AG11-HC,，4mm 流動(dòng)相組成：KOH梯度淋洗0→20分鐘，20→50 mmol/L,；20→24分鐘,，50 mmol/L； 24→25分鐘,，50→20mmol/L,；25→ 30分鐘，20mmol/L,。 流速：1.2 mL/min 柱溫：30℃
檢測(cè)方式：抑制型電導(dǎo)檢測(cè)
進(jìn)樣量：25 µL
樣品前處理
有關(guān)物質(zhì)的樣品制備
精密稱(chēng)取氯膦酸二鈉約15mg,，置10ml量瓶中，用水 溶解并稀釋至刻度,，搖勻,，即得原料供試品溶液；精密 量取注射液2ml,，置100ml量瓶中,，用水稀釋至刻度，搖 勻,，即得注射液供試品溶液,。分別精密量取上述供試品溶 液1ml，置100ml量瓶中,，用水稀釋至刻度，搖勻,，即得 對(duì)照溶液
含量測(cè)定的樣品制備
精密稱(chēng)取氯膦酸二鈉對(duì)照品約15mg,，置100ml量瓶 中，用水溶解并稀釋至刻度,，搖勻,，即得對(duì)照品溶液。 精密稱(chēng)取氯膦酸二鈉約15mg,，置100ml量瓶中,，用水溶 解并稀釋至刻度，搖勻，即得原料供試品溶液,。精密量 取本品2ml,，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度,，搖勻,， 精密量取本品5ml，置50ml量瓶中,，用水稀釋至刻度,，搖 勻，即得注射液供試品溶液,。取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物,， 研細(xì)，精密稱(chēng)取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于氯膦酸二鈉240mg),， 置100ml量瓶中,，加水適量，超聲處理10分鐘,，放冷,， 加水稀釋至刻度，搖勻,，濾過(guò),，精密量取續(xù)濾液5ml，置 100ml量瓶中,，加水稀釋至刻度,，搖勻，即得膠囊供試品 溶液,。
結(jié)果與討論
1 有關(guān)物質(zhì)
1.1 色譜系統(tǒng)的確定
抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)水溶液中離子狀態(tài)存在的成分是 一種具有較高靈敏度的通用型檢測(cè)器,。NaOH或KOH是一 種非常理想的淋洗液，淋洗液中的Na+或K+在抑制反應(yīng)中 與再生液中H+發(fā)生交換,，H+與OH-結(jié)合成低電導(dǎo)的水,，使 淋洗液背景的電導(dǎo)大大降低，同時(shí)增加了被測(cè)離子的靈敏 度,。但這種堿性溶液非常容易吸收空氣中的CO2,，CO2在 堿性溶液中轉(zhuǎn)變成淋洗液強(qiáng)度較OH強(qiáng)的CO32-，導(dǎo)致高的 噪音并改變色譜行為,。淋洗液在線(xiàn)發(fā)生器可獲得純的OH溶液,，與對(duì)OH-優(yōu)化的親水性分離柱結(jié)合后能獲得基線(xiàn)變 化極小的梯度淋洗系統(tǒng)，有望成為測(cè)定藥品有關(guān)物質(zhì)的一 種通用型分析手段,。 抑制型電導(dǎo)檢測(cè)離子色譜方法在測(cè)定藥品雜質(zhì)方面的 應(yīng)用已有報(bào)道[10,14],。進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20060101采用 了復(fù)雜的曲線(xiàn)梯度洗脫方式，根據(jù)生產(chǎn)工藝只選擇兩種雜 質(zhì)進(jìn)行測(cè)定[10]。本文采用常見(jiàn)的線(xiàn)性梯度洗脫方式,，主成 分與各種雜質(zhì)分離良好,，見(jiàn)圖1
氯膦酸二鈉原料的國(guó)家現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還采用與標(biāo)準(zhǔn)氯 化鈉溶液和磷酸鹽溶液比色的方法檢查氯化物和磷酸鹽， 采用間接碘量法檢查亞磷酸鹽,，操作過(guò)程冗長(zhǎng)費(fèi)時(shí),，需用 多種化學(xué)試劑，消耗大量樣品,，靈敏度低而且有干擾[1],。 采用新的線(xiàn)性梯度洗脫方法，不僅能將雜質(zhì)與主成分* 分離,，而且氯離子,、亞磷酸根離子和磷酸根離子均與其他 雜質(zhì)*分離，因此可以替代現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法同時(shí) 準(zhǔn)確測(cè)定原料中的氯化物,、亞磷酸和磷酸,，大大提高檢 驗(yàn)效率。
1.2 檢測(cè)限,、溶液的穩(wěn)定性和強(qiáng)制破壞實(shí)驗(yàn) 按信噪比為3計(jì)算,，氯膦酸二鈉的檢測(cè)限約為0.3 ng。
取注射液供試品溶液1份,，分別在0小時(shí),、17小時(shí)、 19小時(shí),、20小時(shí)和23小時(shí)后進(jìn)樣,，大雜質(zhì)含量和總雜 質(zhì)含量均無(wú)明顯變化，主成分峰面積的RSD為0.6%,。 取注射液樣品5份,，分別用0.1mol/L鹽酸2ml、 0.1mol/L氫氧化鈉溶液2ml,、3%過(guò)氧化氫溶液2ml,、 100℃加熱1小時(shí)和3000Lx強(qiáng)光照射1天處理，考察降解 產(chǎn)物與主成分的分離情況,。結(jié)果顯示,，溶液狀態(tài)下的氯膦 酸二鈉對(duì)熱和氧化不穩(wěn)定(圖2)，加熱和氧化后相對(duì)保留 時(shí)間約0.37和0.17的雜質(zhì)含量分別明顯增加,；對(duì)光,、酸和 堿穩(wěn)定,。固體狀態(tài)下氯膦酸二鈉性質(zhì)穩(wěn)定,，在105℃加熱 18小時(shí)失去四個(gè)結(jié)晶水后雜質(zhì)含量也幾乎未增加。采用 上述色譜條件，破壞性試驗(yàn)產(chǎn)生的各種雜質(zhì)對(duì)主成分峰的 測(cè)定無(wú)干擾,。
1.3 樣品的有關(guān)物質(zhì)
分別取對(duì)照溶液和取供試品溶液注入色譜儀,，記錄色 譜圖，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算大雜質(zhì)含量和雜質(zhì)總含 量,，結(jié)果見(jiàn)表1,。氯膦酸二鈉在溶液中受熱不穩(wěn)定，而其 注射液一般采用高溫濕熱滅菌的生產(chǎn)工藝,，因此雜質(zhì)含量 比原料明顯增多，需要進(jìn)行控制,。C廠(chǎng)批號(hào)為74090的注 射液雜質(zhì)含量少,。由于在上述色譜條件下，主成分色譜 峰與各雜質(zhì)色譜峰,、各主要雜質(zhì)色譜峰之間均基本*分 離,，如有雜質(zhì)對(duì)照品，可用更準(zhǔn)確的對(duì)照品法或帶校正因 子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì),。
2 含量測(cè)定
2.1 色譜條件的選擇
在有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件基礎(chǔ)上,，將梯度洗脫改為 45mmol KOH溶液的等度洗脫測(cè)定含量，其他條件相同,。 按照注射液和膠囊處方稱(chēng)取適量的空白輔料配制成供試品 溶液,，結(jié)果顯示輔料不干擾主成分的含量測(cè)定。用水溶液 中常見(jiàn)的氟,、碳酸根,、硫酸根、溴,、硝酸根和原料中需要 控制的氯,、亞磷酸根和磷酸根八種離子與氯膦酸二鈉對(duì)照 品溶液混合后進(jìn)樣分析，在上述色譜條件下氯膦酸二鈉與 八種陰離子能*分離（圖3）,，主成分色譜峰出峰時(shí)間 約為7.2分鐘,。
采用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器的離子色譜系統(tǒng)比傳統(tǒng)的液相 色譜系統(tǒng)需要更長(zhǎng)的平衡時(shí)間。在本文的色譜條件下,，一 般需要至少預(yù)先平衡約1天時(shí)間,，如抑制器為新抑制器或 長(zhǎng)時(shí)間未使用，則需要更長(zhǎng)的平衡時(shí)間,。適當(dāng)增大抑制器 電流可加快系統(tǒng)的平衡。例如,，連續(xù)平衡1天后注射液含 量測(cè)定的6次進(jìn)樣重復(fù)性和6小時(shí)溶液穩(wěn)定性分別為0.6% 和0.8%,，連續(xù)平衡2天后膠囊含量測(cè)定的6次進(jìn)樣重復(fù)性 和6小時(shí)溶液穩(wěn)定性分別為0.2%和0.3%,，均優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào) 道的柱后衍生離子色譜法[11],。采用供試品溶液與對(duì)照品 溶液平行進(jìn)樣的方式也能減少抑制型電導(dǎo)離子色譜方法 的誤差,。
2.2 回收率
按注射液和膠囊處方，分別精密稱(chēng)取氯膦酸二鈉和輔 料適量,，配成相當(dāng)于測(cè)試濃度80%,、100%和120%的三 種濃度的溶液,，每個(gè)濃度各三份供試品溶液,，按上述方法 測(cè)定含量,，注射液和膠囊的平均回收率為分別為100.1% 和98.9%,，RSD分別為0.7%和0.6% (n=9),。
2.3 線(xiàn)性范圍,、重復(fù)性和溶液的穩(wěn)定性 精密稱(chēng)取四水氯膦酸二鈉對(duì)照品23.85mg，置 100ml 量瓶中,，加水稀釋至刻度,，搖勻，分別精密量取3ml,、5 ml,、7 ml、8ml分別置 10ml量瓶中,，加水稀釋至刻度,，搖 勻，分別進(jìn)樣測(cè)定,。以峰面積A對(duì)濃度c進(jìn)行線(xiàn)性回歸,， 得回歸方程為A = 50.151c－0.255 (r=0.9999，n=5),。表 明氯膦酸二鈉濃度在0.0568～0.1895mg/ml范圍內(nèi),，峰面 積與測(cè)定濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。
取注射液和膠囊供試品溶液各一份連續(xù)進(jìn)樣6次,，主 成分峰面積的RSD%分別為0.6%和0.2%,。 取注射液和膠囊供試品溶液各1份,，分別連續(xù)6小時(shí) 進(jìn)樣,，主成分峰面積的RSD分別為0.8%和0.3%。
2.4 樣品含量測(cè)定
分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定,，按外標(biāo)法 以峰面積計(jì)算含量,，測(cè)定結(jié)果與原方法的比較見(jiàn)表1,。其 中，原料為按國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的容量分析法檢驗(yàn),，按干燥品 計(jì)算的含量結(jié)果；制劑為廠(chǎng)家按照國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的自檢結(jié) 果,?？梢钥闯觯x子色譜方法與原方法的測(cè)定結(jié)果基本一 致,。該方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理,，操作更簡(jiǎn)單，檢驗(yàn) 更快捷,，專(zhuān)屬性更強(qiáng),。
結(jié)論
賽默飛ICS系列離子色譜在檢測(cè)離子型或可離子化藥物方面具有很 大的優(yōu)勢(shì)。氯膦酸二鈉在水溶液中呈弱酸性,，在堿性介質(zhì) 中可轉(zhuǎn)變成為陰離子,，因此可以用離子色譜法測(cè)定其含 量及有關(guān)物質(zhì)。本研究應(yīng)用抑制電導(dǎo)型離子色譜法同時(shí)測(cè) 定氯膦酸二鈉及其制劑的有關(guān)物質(zhì)和含量,，方法準(zhǔn)確,、靈 敏、專(zhuān)屬,、快速,，避免了復(fù)雜的樣品預(yù)處理和衍生化過(guò) 程，同時(shí)測(cè)定多種組分,，能更好地控制氯膦酸二鈉及其制 劑的產(chǎn)品質(zhì)量,。