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基于 Orbitrap平臺的簡單快速抗體藥物天冬氨酸異構(gòu)化解析
閱讀：4157 發(fā)布時間：2019-4-28關(guān)鍵詞 Fusion、 Proteome Discoverer,、單抗,、天冬酰胺脫氨基化,、 天冬氨酸異構(gòu)化
1. 前言
進(jìn)入臨床實驗和正在研發(fā)的單抗藥物日趨增加，對于單抗 藥物的安全性和有效性評價的測試也越發(fā)重要,。與小分子 藥物相比,，單抗藥物更易在生產(chǎn)、運輸和儲存的過程中,， 發(fā)生各種翻譯后修飾的變化,，比如單抗中甲硫氨酸和酪氨 酸氧化，天冬酰胺脫酰胺化,，天冬氨酸異構(gòu)化等都會影響 藥物分子的穩(wěn)定性,，同時影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。因此,， 對各種翻譯后修飾的質(zhì)控分析也提出了更高要求,。目前使 用 LC-MS/MS 在線分析質(zhì)譜技術(shù)，在常規(guī)的肽圖分析中,， 可以同時對多種翻譯后修飾進(jìn)行定性和定量分析,，比如甲 硫氨酸氧化、N 糖基化,、天冬酰胺脫酰胺化,，但對于天冬 氨酸異構(gòu)化我們關(guān)注的都比較少，本文我們?yōu)榇蠹姨峁└?加完整的天冬氨酸異構(gòu)化解決方案,，有助于單抗藥物的精 細(xì)質(zhì)控分析,。
天冬氨酸（D）異構(gòu)化是一種自發(fā)性的非酶翻譯后修飾， 發(fā)生異構(gòu)化后的天冬氨酸（isoAsp）, 在蛋白骨架中插入了 一個亞甲基,，也就是同時天冬氨酸側(cè)鏈減少了一個亞甲基,， 如圖 1 所示，因此引起蛋白結(jié)構(gòu)的變化,，從而引起蛋白功 能的變化,。抗體 CDR 區(qū)域中天冬氨酸異構(gòu)化已被證實會 降低受體結(jié)合效率,，影響終的藥效,。位于鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域， 或者位于 DG/DS（G 為甘氨酸,，S 為絲氨酸）區(qū)域的天冬 氨酸易發(fā)生異構(gòu)化,。同時在弱酸性溶液中，會增加天冬氨 酸異構(gòu)化的水平,。在天冬酰胺（N）發(fā)生脫酰胺化時，會 伴隨帶來天冬氨酸異構(gòu)化,，并且異構(gòu)化的水平和非異構(gòu)化 的水平基本在 3:1 的比例,，一般包含 NG 區(qū)域和 PENNY（P 為脯氨酸,，E 為谷氨酸，Y 為酪氨酸）區(qū)域的天冬酰胺易發(fā)生脫酰胺化,，并帶來天冬氨酸異構(gòu)化,。由于異構(gòu)化本身 不會引起分子量和電荷的變化，因此大大增加分析的難度,。 在完整蛋白的水平上,，可以使用離子交換和親和色譜進(jìn)行 天冬氨酸異構(gòu)化分析，不過對于低豐度的異構(gòu)化水平就無 法準(zhǔn)確確定,，因此,，我們需要在肽段水平上進(jìn)行天冬氨酸 異構(gòu)化的分析，當(dāng)使用反相色譜（RP）進(jìn)行分析時,，一般 異構(gòu)化的肽段會優(yōu)先于未異構(gòu)化的肽段被洗脫下來,，不過 在受到柱子填料和流動相添加離子對試劑等因素影響時， 同樣會出現(xiàn)晚于未異構(gòu)化肽段流出的現(xiàn)象,。目前,，在常用 的碰撞誘導(dǎo)激活解離（CID）和高能碎裂（HCD）進(jìn)行二 級碎裂時，無法通過碎片離子進(jìn)行天冬氨酸異構(gòu)化的確認(rèn),。 ETD 作為一種補(bǔ)充碎裂方式,，尤其在進(jìn)行長肽段，翻譯后 修飾肽段和完整蛋白水平分析時,，可以提供與 CID/HCD 互補(bǔ)以及 ETD 特征性的碎片離子,，從而準(zhǔn)確的確定氨基酸 序列以及翻譯后修飾位點的信息。本篇中使用電子轉(zhuǎn)移解 離（ETD）時,，包含天冬氨酸異構(gòu)化的碎片會產(chǎn)生相應(yīng)的 特征質(zhì)量增加,，如圖 2 所示，因此可以準(zhǔn)確的判斷天冬氨 酸異構(gòu)化的位點,。
本文基于Thermofisher 新的三合一超高分辨質(zhì)譜儀 Orbitrap Fusion Lumos, 采用ETD 碎裂方式,，建立了天冬 氨酸異構(gòu)化質(zhì)譜解析方法，可以廣泛的應(yīng)用到常規(guī)抗體藥 物肽段的精細(xì)解析中
2 實驗部分
2.1 儀器和試劑
質(zhì)譜儀器：Orbitrap Fusion Lumos（賽默飛世爾科技,，美國）,；
色譜儀器：Easy nLC 1000液相色譜系統(tǒng)（賽默飛世爾科技， 美國）,；
Dione×3000UPLC超高壓常規(guī)液相系統(tǒng)（賽默飛世爾科技,， 美國）；
色譜柱：Home made Nano column（C18,，2 µm,， 75 µm×150 mm ，100 Å）；
Waters BEH（C18,，1.7 µm,，2.1×150 mm ，100 Å）
試劑：質(zhì)譜級甲酸,、二次去離子水,，質(zhì)譜級乙腈
2.2 儀器方法
色譜分析條件：具體見表 1；
質(zhì)譜分析參數(shù)：具體見表 2,；
2.3 數(shù)據(jù)分析方法
使用Proteome Discoverer2.1 軟件對原始譜圖進(jìn)行氨基酸序 列分析,，數(shù)據(jù)庫為抗體藥物對應(yīng)的氨基酸序列，具體搜庫參 數(shù)為：半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設(shè)置為固定修 飾,；甲硫氨酸 (M) 氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）,、谷 氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）設(shè)置為可變修飾；酶切 為 trypsin,；酶漏切位點為 2,。
3. 結(jié)果與討論
經(jīng)過 PD 檢索之后，通過設(shè)置脫酰胺化后修飾和查找包含 天冬氨酸異構(gòu)化的特征碎片離子,，在該抗體的酶解肽段中,， 終準(zhǔn)確鑒定到發(fā)生天冬氨酸異構(gòu)化的肽段有兩條，該結(jié) 果與文獻(xiàn)報道的易發(fā)生天冬氨酸異構(gòu)化的肽段一致 [1,2],。
條發(fā)生天冬氨酸異構(gòu)化的肽段為 VVSVLTVLHQDWLNGK,， 其二級碎裂譜圖如圖 3 所示，其中第 14 位的 N 發(fā)生了脫 酰胺化,，并且在該過程中,，產(chǎn)生了異構(gòu)化的天冬氨酸，我 們可以觀察到 c13 和 c13+57 兩個特征碎片離子,，如圖 4 所示,，因此可以準(zhǔn)確確定異構(gòu)化的發(fā)生，同時我們也進(jìn)行 了一級峰提取,，不過由于這條肽段的非脫酰胺化形式和發(fā)生天冬氨酸異構(gòu)化的形式疏水性差別不夠明顯,，或者說目 前使用的反相色譜柱還沒有足夠的分離能力，因此該肽段 的不同翻譯后修飾形式無法得到有效的色譜分離,，從而無 法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析,，期間為提高色譜分離效果，我們 嘗試使用常規(guī)液相分析,，但是沒有得到很好的分離效果,， 另外由于使用常規(guī)液相，反而降低翻譯后修飾肽段的檢出,。 因此,，推薦在不進(jìn)行定量分析的情況下,，我們優(yōu)先考慮納 升級液相和質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行高靈敏度的肽段翻譯后修飾檢 測。
第二條包含異構(gòu)化位點的肽段為 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK,， 其二級碎裂譜圖如圖 5 所示,，其中第 14 和第 19 位的 N發(fā) 生了脫酰胺化，并且在該過程中,，第 14 位的天冬酰胺發(fā)生 了異構(gòu)化，我們可以觀察到 c13 和 c13+57 兩個特征碎片離 子,，如圖 6 所示,，因此可以準(zhǔn)確確定天冬氨酸異構(gòu)化的發(fā)生。 同樣由于色譜分離度不夠,，因此無法進(jìn)一步的定量分析,。
4. 結(jié)論 本文基于新的三合一超高分辨質(zhì)譜 Orbitrap Fusion Lumos 分析平臺, 采用ETD 碎裂方式，建立了天冬氨酸異構(gòu)化質(zhì) 譜解析方法,，為單抗藥物的準(zhǔn)確,、快速、精細(xì)解析提供了可 靠的分析手段,，尤其當(dāng)一些藥物質(zhì)控分析中出現(xiàn)異常電荷異 質(zhì)性或藥物異常降解時,，可以進(jìn)行肽圖水平的質(zhì)譜分析