實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時,，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目,。 

具體操作： 

1. 將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈,，并將蓋片蓋在計數(shù)板。 

2. 將細胞懸液吸出少許,，滴加在蓋片邊緣,，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min,，注意蓋片下不要有氣泡,，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 

3. 計算板四大格細胞總數(shù),，壓線細胞只計左側(cè)和上方的,。然后按公式計算： 細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×104 

說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù),。 公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3  

（注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團,，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團10%以上,，說明分散不好,，需重新制備細胞懸液）   

細胞計數(shù)板的使用  

血球計數(shù)板-基本構(gòu)造 

血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有四個槽構(gòu)成三個平臺,。中間的平臺較寬,，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各刻有一小方格網(wǎng),，每個方格網(wǎng)共分九個大格,，中央的一大格作為計數(shù)用，稱為計數(shù)區(qū),。計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開）,，而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開）,，而每個大方格又分成16個小方格,。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點,，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成,。

計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為1mm2,，每個小方格的面積為1/400mm2,。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm,，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3,，每個小方格的體積為1/4000mm3,。 

使用細胞計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量,，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量,。 細胞計數(shù)板-使用方法 

1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋100倍）,，以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度,。 

2．取潔凈的細胞計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片,。 

3．將菌懸液搖勻，用滴管吸取少許,，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多）,，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生,，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液,。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上（不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后,，造成計數(shù)區(qū)深度的升高）,，然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。 

4．靜置片刻,，使細胞沉降到計數(shù)板上,，不再隨液體漂移。將細胞計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn),，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后,，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近,，觀察時應(yīng)減弱光照的強度,。 

5．計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位,，數(shù)左上,、左下、右上,、右下的4個大方格（即100小格）的菌數(shù),。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外,，還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)（即80個小格）,。為了保證計數(shù)的準確性，避免重復(fù)計數(shù)和漏記,，在計數(shù)時,，對沉降在格線上的細胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定,。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線,，數(shù)左線不數(shù)右線,，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格,，本格的下線和右線上的細胞按規(guī)定計入相應(yīng)的格中,。見下圖：即本格中計數(shù)細胞為3個。

6．對于出芽的酵母菌,，芽體達到母細胞大小一半時,，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)計數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大,，否則應(yīng)重新操作）,，按公式計算出每mL（g）菌懸液所含細胞數(shù)量。 

7．測數(shù)完畢,，取下蓋玻片,，用水將細胞計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦,，以免損壞網(wǎng)格刻度,。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內(nèi)保存,。 細胞計數(shù)板-計數(shù)公式 

1,、16格×25格的細胞計數(shù)板計算公式：細胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細胞個數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù) 

1、25格×16格的細胞計數(shù)板計算公式：細胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細胞個數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)  

血細胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差,力求準確? 血細胞計數(shù)的誤差分別來源于技術(shù)誤差和固有誤差,。其中由于操作人員采血不順利,，器材處理、使用不當,，稀釋不準確,，細胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術(shù)誤差；而由于儀器（計數(shù)板,、蓋片,、吸管等）不夠準確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細胞分布不均勻等因素帶來的細胞計數(shù)誤差屬于分布誤差或計數(shù)域誤差（filed error）,。儀器誤差和分布誤差統(tǒng)稱為固有誤差或系統(tǒng)誤差,。技術(shù)誤差和儀器誤差可通過規(guī)范操作、提高熟練程度和校正儀器而避免或糾正,，但細胞分布誤差卻難于*消除,。因此，搞好紅細胞計數(shù)的質(zhì)量控制一般需采用以下措施,。 1．避免技術(shù)誤差,，糾正儀器誤差 

（1）所用器材均應(yīng)清潔干燥,，計數(shù)板、血蓋片,、微量吸管及刻度吸管的規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正,。①計數(shù)板的鑒定：要求計數(shù)室的臺面光滑、透明,，劃線清晰,，計數(shù)室劃線面積準確。必要時采用嚴格校正的目鏡測微計測量計數(shù)室的邊長與底面積,，用微米千分尺測量計數(shù)室的深度,。美國國家標準局（NBS）規(guī)定每個大方格邊長的誤差應(yīng)小于1%，即1±0.01mm,，深度誤差應(yīng)小于2%,，即0.1±0.002mm。若超過上述標準,，應(yīng)棄之不用。②血蓋片應(yīng)具有一定的重量,，平整,、光滑、無裂痕,，厚薄均勻一致,，可使用卡尺多點測量（至少在9個點），不均勻度在0.002mm之內(nèi),。必要時采用平面平行儀進行測量與評價,，要求呈現(xiàn)密集平行的直線干涉條紋。簡單的評價方法是將潔凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上,，若能吸附一定的時間不脫落,，落下時呈弧線形旋轉(zhuǎn)，表示蓋片平整,、厚薄均勻,。同時,，合格的蓋片放置在計數(shù)室表面后,，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合后,，在掠射光線下觀察,，如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質(zhì)量也符合要求。③目前臨床實驗室多采用一次性微量采血管采集毛細血管血,，除注意定點購買使用信譽較好廠家的產(chǎn)品外,，還應(yīng)對每一批量的采血管進行抽樣檢查,，可通過水銀稱重法或有色溶液比色法進行校正，誤差不應(yīng)超過±1%,。 

（2）紅細胞稀釋液應(yīng)等滲,、新鮮、無雜質(zhì)微粒,。 

（3）嚴格操作,，從消毒、采血,、稀釋,、充池到計數(shù)都應(yīng)規(guī)范，尤其應(yīng)注意的是

血樣稀釋及充池時既要作到充分混勻,，又要防止劇烈震蕩為破壞紅細胞,。必須一次性充滿計數(shù)室,，防止產(chǎn)生氣泡,，充入細胞懸液的量以不超過計數(shù)室臺面與血蓋片之間的矩形邊緣為宜。

（4）報告法定計量單位,。 

2．縮小計數(shù)域誤差或分布誤差  由于血細胞在充入計數(shù)室后呈隨機分布或稱Poisson分布（ ），而我們所能計數(shù)的細胞分布范圍是有限的,，由此造成的計數(shù)誤差稱為計數(shù)域誤差或分布誤差,?？s小這種誤差的有效方法就是盡量擴大細胞計數(shù)范圍和計數(shù)數(shù)目,，一般*行誤差估計,，然后決定所需計數(shù)的數(shù)目和計數(shù)范圍,，只要能將誤差控制在允許范圍內(nèi)即可。Berkson指出,，當使用同一支吸管,、同一面計數(shù)室,，計數(shù)0.2mm2面積的細胞數(shù),，有望將 CV控制在可接受的7%以內(nèi),。對于紅細胞計數(shù)而言,，由于紅細胞數(shù)量較多，在計數(shù)室中顯得比較“擁擠”，根據(jù)Poisson公式（ ）推斷,， ,。欲將誤差控制在變異百分數(shù)5%以內(nèi)，至少需要在計數(shù)室中計數(shù)400個紅細胞,，因此要求計數(shù)五個中方格的紅細胞,。事實上Berkson還通過實驗證明，紅細胞的計數(shù)域誤差為s=0.92 ,，較理論誤差（Poisson分布誤差）要小,。 

3．排除異常標本的干擾  白細胞數(shù)量在正常范圍時，相對于紅細胞數(shù)量來講,，其影響可忽略，但如白細胞過高（>100×109/L）,，則應(yīng)對計數(shù)結(jié)果進行校正,。方法是：①實際RBC=計得RBC-WBC。如當紅細胞換算后為3.5×1012/L,、白細胞換算后為100×109/L時,，病人實際紅細胞數(shù)應(yīng)為3.4×1012/L。②在高倍鏡下計數(shù)時,，避開有核細胞,。有核細胞體積比正常紅細胞大，中央無凹陷,，無草黃色折光，可隱約見到細胞核,。此外,，當病人急性嚴重貧血時網(wǎng)織紅細胞可提前大量釋放，也給紅細胞計數(shù)帶來一定的干擾,，而且影響網(wǎng)織紅細胞值計算結(jié)果,。其校正方法有待探討。